鈣神經(jīng)蛋白抑制劑對糖尿病腎臟炎癥的調(diào)節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、背景:
　　糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病微血管的嚴重并發(fā)癥之一,目前已逐漸成為導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要原因。在歐美等發(fā)達國家DN是ESRD的首位原因(30％～40%),在中國為第二位,且有逐漸增多趨勢。DN的發(fā)病機制至今并不十分清楚,近年來炎癥學(xué)說倍受關(guān)注,并認為DN是一種代謝紊亂誘導(dǎo)的炎癥性疾病,其中巨噬細胞浸潤是DN炎癥的特征性表現(xiàn)之一,也是DN發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。而DN時蛋白尿

2、的形成與腎組織內(nèi)炎癥及腎小球濾過屏障通透性改變密切相關(guān)。足細胞位于濾過屏障的外層,其損傷參與了蛋白尿形成等DN早期病理進程。DN的顯著特征是基質(zhì)蛋白的聚積最終導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化,以往很多研究集中在腎小球病變上,但腎小管病變及腎小管-間質(zhì)纖維化在DN中的重要作用逐漸被大家所認識。腎小管-間質(zhì)病變是DN進展的主要病理基礎(chǔ)之一,是影響DN預(yù)后的十分重要的因素。腎小管上皮細胞肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化(tubularepithelialmyof

3、ibroblasttransdifferentiation,TEMT)可能是DN中腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是處于靜息或非活化狀態(tài)的巨噬細胞并無損傷作用,只有被激活的巨噬細胞才能有效發(fā)揮其炎癥效應(yīng)。Toll樣受體家族(TLRs)正是參與免疫炎癥反應(yīng)的一個關(guān)鍵因素,且認為是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的主體。他克莫司(tacromulis)即FK506是一種鈣神經(jīng)蛋白(Calcineurin,CaN)抑制劑,目前已被用于多種腎臟疾病(如腎移植術(shù)

4、后、狼瘡性腎炎、難治性腎病綜合征)的治療,具有腎臟保護作用。有報道指出FK506發(fā)揮抑制免疫、抗炎活性可能與抑制CaN、骨橋蛋白(Ostepontin,OPN)、NF-κB等多種炎性細胞因子的表達有關(guān)。
　　目的:
　　(1)本研究中,通過建立鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,使用FK506干預(yù),探討其對糖尿病大鼠腎臟保護作用及可能分子機制;(2)探討FK506是否通過足細胞的保護作用減

5、輕DN大鼠尿白蛋白排泄,并探討其可能機制;(3)探討FK506對DM大鼠腎小管-間質(zhì)損傷的保護作用,并探討其機制;(4)探討FK506對DM大鼠腎臟保護作用的機制與腎臟內(nèi)巨噬細胞浸潤、增殖及活化的關(guān)系,以及探討其可能機制。
　　方法:
　　40只大鼠隨機分為對照組(C)、模型組(DM)、DM+FK5060.5mg/kg?d給藥組(FK5060.5)及DM+FK5061.0mg/kg?d給藥組(FK5061.0),每組10只。

6、采用STZ腹腔內(nèi)注射制造糖尿病大鼠模型。FK506給藥組按0.5、1.0mg/kg?d灌胃,對照組和模型組每日給予等量溶媒,共4周。4周后大鼠血糖、肝功能、腎功能與血脂由全自動生化分析儀測定,24小時尿白蛋白測定采用酶聯(lián)免疫方法(EnzymeImmunoassay,EIA)。觀察大鼠腎重/體重、尿白蛋白排泄率(AER)與肌酐清除率(Ccr)變化,在光鏡、電鏡下觀察腎臟病理組織學(xué)改變。應(yīng)用免疫熒光檢測腎組織Nephrin和Podocin表

7、達情況。并應(yīng)用免疫組化單染及雙染技術(shù)檢測各組大鼠腎組織骨橋蛋白(OPN),轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1),E-鈣黏蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin),巨噬細胞浸潤(單核/巨噬細胞表面特異性標志抗原ED-1+細胞),增殖細胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen,PCNA巨噬細胞增殖指標),TLR2,TLR4,核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB-p-p65),誘生性一氧化氮合酶(Induc

8、iblenitricoxidesynthase,iNOS巨噬細胞活化指標)表達情況。應(yīng)用Western印跡檢測CaN、1α(IV)型膠原、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Nephrin、Podocin、NF-κB-p65及NF-κB-p-p65蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.各組大鼠生化指標變化與C組相比,DM組大鼠表現(xiàn)為血糖升高、體重下降、相對腎重(腎重/體重)增加(P<0.01),FK5060.5與1.0mg/kg給藥

9、4wk沒有防止大鼠血糖升高、體重下降。FK5060.5mg/kg給藥組相對腎重較糖尿病組有所下降,但未達統(tǒng)計學(xué)意義,FK5061.0mg/kg給藥組相對腎重明顯低于模型組(P<0.05)。DM組大鼠AER明顯高于對照組(P<0.01),FK5060.5與1.0mg/kg給藥組大鼠AER水平明顯低于模型組(P<0.05,0.01)。FK5060.5與1.0mg/kg給藥組大鼠Ccr水平與DM組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。DM組大鼠血TC、TG

10、水平明顯高于對照組(P<0.05),FK5060.5與1.0mg/kg給藥組血TC、TG水平與模型組相比無明顯差異。另外,與C組相比,DM組、各給藥組血谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶無明顯變化。
　　2.腎組織病理形態(tài)學(xué)變化:DM組4周腎小球平均容量(VG)與損傷指數(shù)(Indicesfortubulointerstitialinjury,TII)明顯高于C組(P<0.05,0.01),提示本模型大鼠已出現(xiàn)腎小球肥大與腎小管-間質(zhì)損害;FK

11、5060.5mg/kg給藥組大鼠VG明顯低于DM組(P<0.05),TII較模型組有所下降,但差異未達統(tǒng)計學(xué)意義,FK5061.0mg/kg給藥組VG與TII均明顯低于模型組(P<0.05,0.01)。透射電鏡觀察DM組腎小球基底膜增厚、結(jié)構(gòu)模糊不清,系膜基質(zhì)增多,足細胞損傷,而與DM組比較,FK5060.5、1.0組腎組織超微結(jié)構(gòu)改變有不同程度改善。
　　3.FK506對糖尿病大鼠腎臟足細胞損傷的保護作用Westernblot法

12、顯示DM組腎組織和FK5060.5,1.0組腎組織CaN蛋白表達分別是C組的2.4倍、1.5倍和0.7倍,FK5060.5與1.0組較DM組分別下降38.0%與73.2%;DM組Nephrin和Podocin較C組表達明顯下降;FK5060.5,1.0組Nephrin和Podocin量較DM組明顯增加,與劑量成正相關(guān)。免疫熒光顯示Nephrin和Podocin在C組大鼠腎小球呈線狀均勻分布,DM組大鼠腎小球表達明顯減少、且呈顆粒狀不均勻

13、分布;FK5060.5,1.0組Nephrin和Podocin表達不同程度增加,呈線狀及顆粒狀分布。
　　4.FK506對糖尿病大鼠腎小管-間質(zhì)損傷的保護作用C組大鼠腎小球與腎小管-間質(zhì)有微弱TGFβ1蛋白表達,模型組腎小球與腎小管-間質(zhì)TGFβ1蛋白表達明顯高于C組(P<0.01),K5060.5與1.0mg/kg給藥組腎小球與腎小管-間質(zhì)TGFβ1蛋白表達明顯低于DM組(P<0.05,0.01)。免疫組化顯示DM組腎小管-間質(zhì)

14、E-cadherin表達陽性面積明顯低于C組(P<0.01),FK5060.5、1.0組表達陽性面積明顯高于DM組(P<0.01),DM組腎小管α-SMA與Vimentin表達明顯高于對照組(P<0.01),FK5060.5、1.0組表達明顯低于DM組(P<0.01)。Westernblot法顯示DM組腎組織和FK5060.5,1.0組腎組織α-SMA蛋白表達較C組分別增加3.5倍、2.1倍和1.1倍,FK5060.5,1.0組較DM組

15、分別下降40.7%與69.1%。而DM組、FK5060.5和1.0組腎組織1α(IV)型膠原蛋白表達較C組分別增加2.4倍、1.6倍和1.2倍,FK5060.5,1.0給藥組較DM組分別下降34.5%與50.0%。
　　5.FK506對糖尿病大鼠腎臟巨噬細胞增殖激活的影響免疫組化顯示DM組大鼠腎組織ED-1+、PCNA+、TLR2+、TLR4+及iNOS+巨噬細胞數(shù)明顯高于C組(P<0.01),FK5060.5,1.0給藥組ED-

16、1+的巨噬細胞數(shù)與DM組比較無明顯變化,PCNA+、TLR2+、TLR4+及iNOS+的巨噬細胞數(shù)明顯低于DM組(P<0.01)。免疫組化法顯示DM組大鼠腎組織NF-κBp-p65蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01),而與DM相比,FK5060.5、1.0組腎組織NF-κBp-p65表達明顯減少(P<0.01)。Westernblot法顯示DM組腎組織NF-κB-p65表達較對照組增加5.33倍,FK5060.5與1.0組腎組織NF-

17、κB-p65表達較DM組分別下降26.32%與47.37%。DM組腎組織NF-κBp-p65表達較對照組增加7.57倍,FK5060.5、1.0組腎組織NF-κBp-p65表達較DM組分別下降56.67%和70.00%。
　　結(jié)論:
　　FK506能減少糖尿病大鼠尿蛋白排泄,減輕腎小球肥大及腎小管-間質(zhì)損傷,改善腎小球基底膜、系膜及足細胞病變,其機制可能與下調(diào)腎組織中NF-κBp-p65、OPN、CaN、α-SMA、Vime