誘導(dǎo)E14小鼠ESC分化為小腸上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、各種原因引起的小腸上皮形態(tài)和功能受損，導(dǎo)致嚴(yán)重的消化吸收不良；以及遷延不愈的腸瘺和Crohn’s病是內(nèi)外科臨床面臨的棘手問(wèn)題。小腸移植，全胃腸外營(yíng)養(yǎng)，應(yīng)用生長(zhǎng)激素等傳統(tǒng)的治療方法有一定療效，但存在供體匱乏，免疫排斥，高額的費(fèi)用，療效欠佳等方面的限制。新的治療途徑正在探索中。 自從1998年Thomson等首次成功分離并建立人胚胎干細(xì)胞系，掀起了全球范圍內(nèi)的干細(xì)胞研究熱潮。胚胎干細(xì)胞(ESC)是一群未分化細(xì)胞，可無(wú)限增殖并分化為機(jī)

2、體的幾乎所有的細(xì)胞類型，構(gòu)建各種組織、器官。所以干細(xì)胞替代療法有望成為組織和器官的損傷或功能衰竭的一種有應(yīng)用前景的治療方法。 目前已經(jīng)證實(shí)，胚胎干細(xì)胞可在體外被定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胰島細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。但是體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向腸上皮細(xì)胞定向分化的研究進(jìn)展仍相當(dāng)緩慢。另外，由于對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中基因激活與沉默的機(jī)制以及胚層，組織和細(xì)胞間的信息網(wǎng)絡(luò)知之甚少，因此，如何建立優(yōu)化的體外誘導(dǎo)體系使ESC定

3、向分化，如何獲得大量純化、穩(wěn)定和成熟的目的細(xì)胞，仍是干細(xì)胞研究的難點(diǎn)。 在特定的體內(nèi)外環(huán)境下胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程中，必然先經(jīng)過(guò)若干前體細(xì)胞階段。本研究擬以小腸上皮發(fā)育生物學(xué)的研究進(jìn)展為外源因子的選擇依據(jù)，按照小腸上皮干細(xì)胞發(fā)育、生長(zhǎng)與所在的環(huán)境密切相關(guān)的規(guī)律，對(duì)體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向小腸上皮細(xì)胞定向分化的研究領(lǐng)域進(jìn)行初步探索。在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、GlutaMAX-Ⅰ及胰島素等為分化誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)液中增加小腸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清，提

4、高誘導(dǎo)的效率和準(zhǔn)確性，從而建立有效的誘導(dǎo)ESC定向分化為干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。 目的 本研究按照ESC定向分化的理論和技術(shù)，探討體外誘導(dǎo)鼠ESC分化為小腸上皮細(xì)胞的可行性，分析小腸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液對(duì)ESC向小腸上皮細(xì)胞分化的影響，為大量獲取用于細(xì)胞移植的小腸上皮細(xì)胞奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 1體外小鼠小腸上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，并根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)特征，以及免疫細(xì)胞化學(xué)

5、染色和免疫熒光染色分別檢測(cè)CK18蛋白和Vimentin蛋白的表達(dá)、AKP染色定性鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞。用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)小腸間質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)收集小腸間質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液，并以原代小腸上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照(原代組)。 2首先體外培養(yǎng)、擴(kuò)增小鼠ESC細(xì)胞系E14；將小鼠ESC細(xì)胞系E14在去除重組鼠白血病抑制因子后用懸滴法培養(yǎng)，使其形成擬胚體；然后分別用加入小腸間質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液(上清組)和未加小腸間質(zhì)細(xì)胞原代培

6、養(yǎng)上清液(非上清組)(兩組培養(yǎng)液中均含20％胎牛血清、2mmol/LGlutaMAX-Ⅰ、20ng/mlEGF、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2μg/ml胰島素)分別體外培養(yǎng)16～21d。對(duì)不同誘導(dǎo)方案下分化的細(xì)胞行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、AKP染色、免疫熒光染色檢測(cè)CK18的表達(dá)、RT-PCR檢測(cè)Msi-1，Hes-1，Cdx2，CK19的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。此外，把不同方案誘導(dǎo)分化的細(xì)胞接種到BABL/c裸鼠皮下，觀察其在體內(nèi)

7、形成小腸黏膜細(xì)胞能力的。 結(jié)果 1倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的小腸上皮細(xì)胞，24～48h可見(jiàn)貼壁；4～6d形成一群群的細(xì)胞集落；10～12d細(xì)胞匯合成片。細(xì)胞為圓形、多角形單層生長(zhǎng)，呈“鋪路石樣”。細(xì)胞漿豐富，核為圓形或卵圓形，含1～2個(gè)核仁，核周可見(jiàn)許多小空泡。免疫組化染色后，可見(jiàn)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，表達(dá)CK18蛋白，陰性對(duì)照細(xì)胞組細(xì)胞未見(jiàn)被染色。以改良Kaplow氏法顯示AKP，細(xì)胞表面呈暗黑或灰黑色陽(yáng)性反應(yīng)。另免疫熒

8、光染色顯示原代小腸間質(zhì)細(xì)胞的胞漿有Vimentin的表達(dá)。 2經(jīng)不同誘導(dǎo)的擬胚體，在1W左右的時(shí)間都可見(jiàn)上皮樣細(xì)胞向周?chē)L(zhǎng)。2W左右上清組的大部分分化細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，呈現(xiàn)較好的均質(zhì)性，但是非上清組的分化細(xì)胞中還存在較多的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞等雜細(xì)胞生長(zhǎng)。繼續(xù)觀察到3W以后，細(xì)胞開(kāi)始死亡、脫落。免疫熒光染色顯示兩組均有大量CK18的表達(dá)。AKP染色顯示上清組細(xì)胞中AKP染色陽(yáng)性的細(xì)胞(26.9±2.5％)較非上清組(1.2±0.9

9、％)高(P＜0.05)。RT-PCR半定量結(jié)果顯示上清組和非上清組的Msi-1和Hes-1mRNA的表達(dá)無(wú)差別(P＞0.05)，但兩組Msi-1和Hes-1mRNA的表達(dá)均高于原代組(P＜0.05)；非上清組Cdx2mRNA的表達(dá)低于上清組和原代組(P＜0.05)，上清組的Cdx2mRNA的表達(dá)低于原代組(P＜0.05)；原代組與非上清組和上清組的CK19mRNA的表達(dá)無(wú)差別(P＞0.01)，而非上清組CK19mRNA的表達(dá)低于上清組(

10、P＜0.01)。對(duì)裸鼠皮下腫物組織切片HE染色后觀察，上清組可見(jiàn)較多的管腔，管腔內(nèi)面可見(jiàn)到明顯的絨毛樣結(jié)構(gòu)，有大量的柱狀上皮細(xì)胞和杯狀上皮細(xì)胞；非上清組管腔結(jié)構(gòu)較少，組織中可見(jiàn)多種細(xì)胞，如軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞等。腫物組織切片AKP染色后觀察，上清組可見(jiàn)管腔內(nèi)面棕黑色線樣沉淀，為AKP陽(yáng)性表現(xiàn)；這種現(xiàn)象在非上清組相對(duì)少見(jiàn)。 結(jié)論 1應(yīng)用中性蛋白酶Ⅰ和粗膠原酶Ⅺ消化可獲比較純化的上皮細(xì)胞。 2應(yīng)用膠原