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文檔簡介
1、目的:在一定的誘導(dǎo)條件下,分別于體內(nèi)外觀察猴表皮干細(xì)胞橫向分化為角膜上皮細(xì)胞的情況。探索體內(nèi)外誘導(dǎo)恒河猴表皮干細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞的可能性及誘導(dǎo)分化條件,為構(gòu)建組織工程角膜和治療嚴(yán)重眼表疾病提供新型的種子細(xì)胞。 方法:1.采用組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法分離培養(yǎng)恒河猴表皮細(xì)胞;用Ⅳ型膠原吸附法分選表皮干細(xì)胞;分選后的細(xì)胞采用免疫熒光組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、流式細(xì)胞儀檢測β1整合素、角蛋白15(CK15)、α
2、6整合素和CD71。 2.分別用Hoechst33342和5-溴-2脫氧尿嘧啶(BrdU)兩種方法標(biāo)記表皮干細(xì)胞。比較兩種標(biāo)記方法的優(yōu)缺點(diǎn)。 3.采用Transwell非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng),用角膜上皮細(xì)胞和角膜緣基質(zhì)組織與表皮干細(xì)胞共培養(yǎng)10天,檢測誘導(dǎo)前后的表皮干細(xì)胞β1整合素、角蛋白15、角蛋白3/12(CK3/12)和角蛋白1/10(CK1/10)的變化,以正常角膜上皮細(xì)胞和未共培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞為對照。分別采用免疫組織
3、化學(xué)染色和RT-PCR的方法鑒定。 4.制作恒河猴角膜上皮缺損模型,利用誘導(dǎo)分化3天并標(biāo)記BrdU的表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞,“去上皮”羊膜為載體,進(jìn)行自體體內(nèi)移植。對側(cè)眼行單純羊膜移植。8周后取材,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組織化學(xué)檢查BrdU、β1整合素、角蛋白15、角蛋白3/12和角蛋白1/10的表達(dá)。透射電鏡檢查術(shù)后植片的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果:1.用Ⅳ型膠原分選體外培養(yǎng)的表皮細(xì)胞,可獲取10%左右的表皮干細(xì)胞。經(jīng)
4、細(xì)胞免疫組織化學(xué)、RT-PCR和流式細(xì)胞儀鑒定,表皮干細(xì)胞呈β1整合素、α6整合素和角蛋白15陽性,CD71陰性。 2.Hoechst33342和BrdU兩種標(biāo)記方法對細(xì)胞均未顯示明顯的毒性。Hoechst33342的標(biāo)記率最高(100%),但隨時間延長熒光有衰減,并且熒光有擴(kuò)散現(xiàn)象,不利于以后的移植實驗;BrdU標(biāo)記細(xì)胞較穩(wěn)定,實驗期間細(xì)胞內(nèi)BrdU無明顯減少,標(biāo)記率較高。 3.共培養(yǎng)10天后,誘導(dǎo)分化后的表皮干細(xì)胞除
5、顯示自身的標(biāo)記(Hoechst33342)外,通過免疫組織化學(xué)染色和RT-PCR的檢查,還發(fā)現(xiàn)β1整合素和角蛋白15表達(dá)水平較誘導(dǎo)前降低,但角蛋白3/12的表達(dá)則由誘導(dǎo)前的陰性轉(zhuǎn)為誘導(dǎo)后的陽性。 4.BrdU標(biāo)記表皮干細(xì)胞羊膜植片行自體眼表移植后8周,眼表上皮化良好:熒光素不著染、角膜透明、新生血管少;組織切片AE5染色陽性,上皮和基底膜結(jié)合緊密,上面4~6層復(fù)層細(xì)胞,胞核BrdU陽性,與正常角膜有相似組織學(xué)結(jié)構(gòu),無結(jié)膜細(xì)胞侵入
6、;超微結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞之間連接緊密,見橋粒結(jié)構(gòu),細(xì)胞與基底膜之間見半橋粒結(jié)構(gòu)。 結(jié)論:1.通過組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法均可獲得表皮干細(xì)胞,Ⅳ型膠原吸附法分選表皮干細(xì)胞是一種簡單、易行而且有效的方法,分選后的干細(xì)胞比例接近85%; 2.用非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng),利用原代培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞和角膜緣基質(zhì)組織作為微環(huán)境,成功誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為角膜上皮樣細(xì)胞,證明了表皮干細(xì)胞的可塑性。為利用表皮干細(xì)胞替代角膜緣干細(xì)胞,重建眼表及構(gòu)建生物角
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