新基因dp3的克隆表達(dá)及其功能初步研究.pdf

1、以人的垂體為材料,在垂體表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)內(nèi)分泌組織特異表達(dá)的新基因,用RT-PCR的方法從垂體cDNA庫里克隆到了該基因.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)新基因即為E2F-Like基因,它定位于人體X染色體長(zhǎng)臂的26.2位點(diǎn)上,其蛋白質(zhì)具有E2F_TDP結(jié)構(gòu)域,和E2F家族的DP1,DP2具有很高的同源性,故將其命名為DP3.成功地構(gòu)建了DP3-1蛋白的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/dp3-1,篩選到最佳誘導(dǎo)條件為0.2mM IPTG,30℃

2、,4hr,誘導(dǎo)后分離純化得到了3mg DP3-1蛋白,用于免疫兔子以得到針對(duì)DP3-1蛋白的抗體,經(jīng)過驗(yàn)證所得抗體的特異性和效價(jià)均很高.同時(shí)成功構(gòu)建了dp3的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)A/dp3,并且證明了dp3基因在真核細(xì)胞中可以較好地得到表達(dá),采用免疫熒光定位法發(fā)現(xiàn)DP3蛋白定位在細(xì)胞的胞漿中.構(gòu)建了中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)穩(wěn)定細(xì)胞株(CHO-AB4),在該穩(wěn)定細(xì)胞株基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)