瘢痕疙瘩成纖維細胞Fas及P53蛋白凋亡缺陷的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景及目的： 對于瘢痕疙瘩來說，目前尚無有效的治療手段，其綜合治療的效果也不理想，存在較高的復(fù)發(fā)率。一般認為瘢痕疙瘩成纖維細胞屬于非正常細胞，與腫瘤細胞類似，雖然組織內(nèi)存在大量凋亡的細胞，但是瘢痕疙瘩成纖維細胞為多克隆來源，體內(nèi)存在不同表型的成纖維細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后細胞變成單一表型，而且這種細胞不易凋亡。尋找瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡缺陷機制及有效誘導其凋亡的方法對瘢痕疙瘩治療有重要意義。 基于以上觀點，課題組致力于研究

2、瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡缺陷的機制，探索瘢痕疙瘩的基因治療，尋找有效的瘢痕疙瘩治療方法。通過對瘢痕疙瘩成纖維細胞p53基因及fas基因系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)：1.瘢痕疙瘩病人血細胞中p53基因第72位密碼子Pro等位基因頻率明顯高于Arg等位基因頻率，與Arg/Arg及Arg/Pro基因型人群相比，Pro/Pro基因型人群易患瘢痕疙瘩。血細胞中p53基因第72位密碼子多態(tài)性位點的基因型檢測對判斷瘢痕疙瘩高危個體具有指導意義，并開發(fā)出了可用于普通人

3、群的p53基因第72位密碼子基因多態(tài)性檢測試劑盒。2.Fas單克隆抗體在ng-μg水平即可迅速誘導增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡，而在相同濃度下，瘢痕疙瘩成纖維細胞對此卻無反應(yīng)。3.增生性瘢痕成纖維細胞Fas表達較低，但瘢痕疙瘩成纖維細胞Fas卻呈高表達，兩者間差異顯著，瘢痕疙瘩細胞的凋亡異常不是由于缺乏受體所導致的。4.瘢痕疙瘩Fas介導死亡信號傳導阻滯，而且阻斷的位點位于上游。5.攜帶正常人fas基因的脂質(zhì)體及重組腺病毒均能有效地將fa

4、s基因?qū)?，并且能使目的基因在靶細胞?nèi)完整且有效的表達，瘢痕疙瘩細胞Fas通道能得以穩(wěn)定重建，且通道重建后瘢痕疙瘩細胞增殖-凋亡狀況的失衡得到了明顯的改善。 通過以上研究結(jié)果，我們對瘢痕疙瘩的發(fā)病機制與p53基因及fas基因的關(guān)系有了比較充分的了解，但是有些問題還值得我們進一步探討。 p53基因外顯子4第72編碼子基因多態(tài)性是近年研究的熱點，不同的基因型與多種腫瘤發(fā)病相關(guān)，其產(chǎn)物對細胞凋亡有不同的影響，局部組織基因型存在

5、相互變異的現(xiàn)象，而且Arg等位基因占優(yōu)勢的腫瘤預(yù)后明顯好于Pro等位基因占優(yōu)勢的腫瘤。瘢痕疙瘩類似良性腫瘤，患者局部組織基因多態(tài)性有無變異，不同的基因型對蛋白的表達有無影響，與臨床表型的關(guān)系如何，這些都是我們必須回答的問題。 與增生性瘢痕相比，瘢痕疙瘩成纖維細胞Fas蛋白表達強陽性，而經(jīng)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞FasMcAb不能有效誘導凋亡，分析其中的原因：其一為Fas蛋白結(jié)構(gòu)異常，導致不能有效誘導凋亡。另外Fas蛋白是一種

6、糖蛋白，只有糖基化的蛋白才能有效表達于細胞膜上，蛋白糖基化的程度與功能存在明顯相關(guān)。因此我們采用WesternBlot法檢測病理性瘢痕成纖維細胞Fas蛋白糖基化水平，PI染色、流式細胞術(shù)檢測成纖維細胞FasMcAb作用后的凋亡率，分析Fas蛋白糖基化水平與FasMcAb誘導凋亡的相關(guān)性，并利用蛋白糖基化抑制劑衣霉素(Tunicamycine，TM)抑制成纖維細胞Fas蛋白糖基化，觀察成纖維細胞Fas蛋白糖基化水平變化后對凋亡的影響。

7、 目前臨床上沒有確切有效的瘢痕疙瘩治療方法，轉(zhuǎn)染野生型fas基因能有效誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，具有廣闊的前景，但是尚不能直接用于病人，短期內(nèi)主要還是研究藥物治療為主。在各種誘導凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路中，受體通路與線粒體通路是2條基本通路。缺氧可有效啟動線粒體依賴的caspases激活途徑誘導凋亡，順鉑可同時啟動Fas受體途徑及線粒體依賴的caspases激活途徑誘導凋亡，這在冠心病發(fā)病機制的研究中及腫瘤的治療中已進行了廣泛的研究，但

8、在瘢痕疙瘩領(lǐng)域，無論在臨床治療或?qū)嶒炑芯恐?，除基因轉(zhuǎn)染外，尚未見報道有效的誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的方法。因此我們利用缺氧及順鉑處理瘢痕疙瘩成纖維細胞，觀察是否能有效誘導其凋亡。 本實驗在課題組先前研究結(jié)果的基礎(chǔ)上再次探討凋亡基因p53及fas，以組織標本及體外培養(yǎng)成纖維細胞為研究對象，旨在闡明它們在瘢痕疙瘩不同部位成纖維細胞凋亡過程中扮演的角色以及功能缺陷的可能機制，并對順鉑及缺氧誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的機制進行了初步探

9、討，為今后這方面的治療工作進行了初步研究。 方法： 1.以正常人為對照，收集35例瘢痕疙瘩病人血標本及組織標本，瘢痕疙瘩組織標本分中央部和周邊部。提取血標本及組織標本的DNA，多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增p53基因外顯子4，并進行基因測序；采用免疫組織化學方法檢測P53蛋白的表達。 2.采用組織培養(yǎng)技術(shù)，以手術(shù)切除的瘢痕疙瘩及增生性瘢痕為組織來源的體外培養(yǎng)的成纖維細胞為研究對象，WesternBlot法及流式細胞

10、術(shù)檢測衣霉素處理前后成纖維細胞Fas糖蛋白的表達及FasMcAb誘導凋亡率的變化。 3.順鉑及缺氧誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，流式細胞術(shù)檢測檢測成纖維細胞凋亡率的變化，WesternBlot法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達的變化。 結(jié)果： 1.p53基因72位編碼子遺傳基因型有三種：CCC/CCC、CCC/CGC、CGC/CGC，其產(chǎn)物分別是Pro/Pro、Pro/Arg、Arg/Arg。瘢痕疙瘩組Pro/Pro

11、、Pro/Arg、Arg/Arg三種遺傳基因型分布與臨床表型密切相關(guān)，大體積瘢痕疙瘩患者遺傳基因型為Pro/Pro，局部瘢痕組織則存在由周邊的Pro向中央Arg變異的趨勢。瘢痕疙瘩P53蛋白表達位于胞漿中，陽性率35/35，與瘢痕疙瘩臨床表型及部位密切相關(guān)。正常皮膚無表達。 2.增生性瘢痕成纖維細胞Fas蛋白糖基化水平高于瘢痕疙瘩成纖維細胞，兩組成纖維細胞FasMcAb作用后凋亡率與Fas蛋白糖基化成正相關(guān)，衣霉素可明顯降低成纖

12、維細胞Fas蛋白糖基化水平及FasMcAb作用后凋亡率。 3.缺氧條件下培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞，其凋亡率及Bcl-2和Bax蛋白的表達無明顯變化。順鉑作用后瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡率增加，Bcl-2的表達下調(diào)，Bax的表達增加。 結(jié)論： 1.瘢痕疙瘩臨床表型與p53基因外顯子4第72編碼子基因多態(tài)性密切相關(guān)，遺傳基因型為Pro/Pro患者一般表現(xiàn)為大體積、多發(fā)；瘢痕疙瘩患者局部組織基因型有Pro向Arg變異的趨勢，