HUVEC原代培養(yǎng)及深低溫凍存復(fù)蘇對其免疫原性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞體外分離、原代培養(yǎng)，并予以鑒定及凍存復(fù)蘇，構(gòu)建臍靜脈細(xì)胞庫，為構(gòu)建組織工程血管提供種子細(xì)胞。 2、初步探討深低溫凍存對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）免疫原性影響，為研究深低溫凍存對血管等組織保存的免疫原性影響提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。 方法： 1、利用0.1%膠原酶消化、分離、體外原代培養(yǎng)臍靜脈血.管內(nèi)皮細(xì)胞，0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化傳代，根據(jù)細(xì)胞特有的形態(tài)

2、學(xué)特征和Ⅷ因子、CD31、CD34細(xì)胞免疫組化及對乙?；疞DL高攝取試驗(yàn)進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定。 2、采用含10%DMSO凍存液分別應(yīng)用常規(guī)梯度降溫及程序降溫盒進(jìn)行凍存2周，37℃水浴快速復(fù)溫來復(fù)蘇，觀察冷凍前后細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)培養(yǎng)凍存前后細(xì)胞數(shù)量，繪制凍存前后細(xì)胞生長曲線，探索深低溫凍存及復(fù)蘇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞較佳方法。 3、單向混合人淋巴細(xì)胞-臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，即使用1×106/mlPBMC和1×105/ml滅活HU

3、VEC共同培養(yǎng)72小時(shí)，加入MTT法，酶聯(lián)免疫板檢測570nm處吸光度，判斷凍存復(fù)蘇前后血管內(nèi)皮細(xì)胞對人PBMC增值情況。 4、流式細(xì)胞儀檢測新鮮和凍存復(fù)蘇2周后細(xì)胞HLA-ABC及HLA-DR抗原的表達(dá)，檢測其HLA-ABC及HLA-DR抗原的表達(dá)變化，判斷其免疫原性的強(qiáng)弱。 5、并利用不同濃度（0，50U/ml，100 U/ml，200 U/ml，300 U/ml，400 U/ml）IFN-γ誘導(dǎo)培養(yǎng)凍存及新鮮的血管

4、內(nèi)皮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測新鮮和凍存復(fù)蘇后細(xì)胞HLA-ABC及HLA-DR抗原的表達(dá)，判斷在模擬體內(nèi)炎癥環(huán)境中新鮮和凍存血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫原性的強(qiáng)弱。 結(jié)果： 1、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)、傳代生長均良好，呈典型的鋪路石樣形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，Ⅷ因子、CD31、CD34細(xì)胞免疫組化顯示早陽性反應(yīng)，及Dil-Ac-LDL攝取熒光檢測提示其具有強(qiáng)攝取能力，從而鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞。 2、臺盼藍(lán)據(jù)染結(jié)果表明利用程序降溫盒凍存

5、復(fù)蘇的細(xì)胞活性為88±5.3%，普通的梯度凍存復(fù)蘇存活率為75.8±8.1%，與程序降溫盒凍存細(xì)胞存活率有顯著差別（P<0.05）。新鮮與深低溫凍存的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)類似，生長增值情況良好，生長曲線類似，未見明顯差別（P>0.05）。 3、單向混合淋巴細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)；MTT結(jié)果顯示新鮮組血管內(nèi)皮細(xì)胞對人外周血淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)為1.716±0.181，凍存組血管內(nèi)皮細(xì)胞對人外周血淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)為1.686±0.145，兩

6、者對外周血淋巴細(xì)胞刺激無顯著差別（P>0.05）。 4、新鮮和深低溫凍存復(fù)蘇的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)HLA-ABC抗原，而不表達(dá)HLA-DR抗原，HLA-ABC抗原表達(dá)率（96.55±1.88 vs95.98±1.4）和平均表達(dá)強(qiáng)度（84.13±5.73 vs82.36±4.75）均未見明顯差別（P>0.05）； 5、通過不同濃度IFN-γ誘導(dǎo)培養(yǎng)后，HLA-ABC抗原的平均表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，HLA-DR抗原的平均表達(dá)強(qiáng)度

7、和表達(dá)率逐漸加強(qiáng)，且呈劑量依賴性，HLA-ABC抗原平均表達(dá)強(qiáng)度新鮮組和凍存組未見明顯差別，但新鮮組中HLA-DR抗原的表達(dá)率和平均表達(dá)強(qiáng)度均高于凍存組（P<0.01）。 結(jié)論： 1、通過本研究，建立了一整套的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)、傳代及凍存復(fù)蘇方法，并通過鑒定，可以初步構(gòu)建臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞庫，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究提供平臺。 2、在無或低（IFN-γ≤50u/ml）免疫炎癥環(huán)境下，深低溫凍存復(fù)蘇2