豬卵母細(xì)胞孤雌激活、體外受精及冷凍保存技術(shù)研究.pdf

1、豬是一種在轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器領(lǐng)域有著廣闊應(yīng)用前景的理想動(dòng)物模型，需要建立一套有效的體外繁殖技術(shù)為轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)提供大量高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞和胚胎。本研究以建立豬細(xì)胞克隆前期激活體系和體外胚胎生產(chǎn)為目的，系統(tǒng)的研究了卵母細(xì)胞成熟體系、體外孤雌激活體系、體外受精體系和冷凍方法。 結(jié)果表明：每月的各級(jí)卵巢百分比走勢(shì)：一級(jí)卵巢比例隨著天氣的變熱逐漸減少，到六、七月達(dá)到低谷；二級(jí)卵巢比例相對(duì)受氣候變化影響較低整體上走勢(shì)都比較平穩(wěn)；三級(jí)卵巢比例

2、則走勢(shì)正好與一級(jí)相反；每個(gè)卵巢采卵平均數(shù)在六月至九月處于低水平，在氣候涼爽的四、五、九、十月的卵巢質(zhì)量和檢卵平均數(shù)比較高。卵母細(xì)胞后半程成熟培養(yǎng)體系中有無激素對(duì)卵母細(xì)胞的成熟率影響差異不顯著(P<0.01)；卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞濃度為100個(gè)/400μl的成熟率最佳；不同成熟體系的成熟培養(yǎng)效果以NCSU-23+10％FBS為最佳；而卵母細(xì)胞激活后發(fā)育培養(yǎng)體系以NCSU-23+BSA卵母細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)效果更好。 用CRY-3細(xì)

3、胞激活儀進(jìn)行電激活時(shí)，脈沖電壓應(yīng)小于等于200V，脈沖時(shí)程可為20μs、40μs、80μs，脈沖次數(shù)應(yīng)低于3次，其中以120v/20μs/1次，150v/20μs/2次兩組的激活效果最佳。電激活(150v/20μs/2次)與幾種化學(xué)激活(5μg/mlCB；CB+2mM/L6-DMAP；CB+150μM/Lγ-BLI)聯(lián)合使用時(shí)，以電+CB+γ-BLI聯(lián)合激活效果最好；比較γ-BLI幾個(gè)濃度梯度的激活效果發(fā)現(xiàn)，以γ-BLI濃度為600μM

4、組的激活效果最為理想。 冷凍精液IVF，多精入卵率隨著共孵時(shí)間或精子濃度的增長(zhǎng)而增加，精卵共孵6h的受精效果最為理想。以解凍后活力為0.1左右的冷凍精液進(jìn)行體外受精時(shí)，精子濃度以10<'7>為宜。兩種不同卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基與受精前兩種不同卵母細(xì)胞去除卵丘處理方法聯(lián)合作用表明，部分去除卵丘組優(yōu)于完全去凈組，其中以NCSU-23+FBS+部分去除卵丘組的IVF后發(fā)育效果最佳。鮮精的體外受精效果，優(yōu)于冷凍后的精液，但除8-細(xì)胞率(78

5、.01±1.53％vs68.09±1.08％)外，各項(xiàng)指標(biāo)差異都不顯著(P>0.05)。 用三種冷凍方法(OPS法；自制移液槍頭法；移液槍頭法+離心法)對(duì)MⅡ卵母細(xì)胞冷凍的結(jié)果表明，自制移液槍頭法優(yōu)于OPS法，其中以移液槍頭法+離心組的冷凍效果最好；用移液槍頭法對(duì)體外發(fā)育到 8-細(xì)胞期卵母細(xì)胞的冷凍效果不理想。MⅡ期卵母細(xì)胞用 OPS 法冷凍后卵母細(xì)胞IVF和電激活的卵裂率都顯著高于移液槍頭法(P<0.01)，電激活后2-細(xì)胞卵

6、裂率比IVF高。 本試驗(yàn)推薦豬體外成熟培養(yǎng)體系為連續(xù)培養(yǎng)液48h的NCSU-23+10％FBS，細(xì)胞濃度為100個(gè)/400μl，發(fā)育培養(yǎng)體系為NCSU-23+BSA；用CRY-3細(xì)胞激活儀電激活時(shí)(電融槽寬度為1mm)為150v/20μs/2次+600μMγ-BLI；以活力為0.1左右的冷凍精液進(jìn)行IVF時(shí)，精子濃度為10<'7>，共孵時(shí)間為6h，并在成熟處理時(shí)只部分去除卵丘細(xì)胞；MⅡ卵母細(xì)胞冷凍時(shí)，方法為移液槍頭法+離心法，冷