體外成熟豬卵母細胞孤雌激活的研究.pdf

1、豬是人異種器官移植理想的器官來源。體細胞核移植為人們生產(chǎn)不引起免疫排斥以及內(nèi)源性病毒的豬提供了可能。成熟卵母細胞經(jīng)移核后激活是核移植的關(guān)鍵步驟之一，卵母細胞的激活率直接影響核移植效率。當前核移植效率低下，其原因之一就是受體卵母細胞未被充分激活。本試驗對影響體外成熟豬卵母細胞孤雌激活的因素進行研究，以便確定豬卵母細胞人工激活的最佳條件。 試驗比較了不同季節(jié)采集的卵巢對卵母細胞孤雌激活的影響；激活液中不同Ca2+濃度搭配不同電脈沖強

2、度對卵母細胞和孤雌胚發(fā)育的影響；首次探討了豬卵母細胞在甘露醇、山梨醇電激液以及此兩種電激液等體積混合液中施加交流電的激活效果；比較了6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethyaminopurine，6-DMAP）、細胞松弛素B（cytochalasin B，CB）、放線菌酮（cycloheximide，CHX）處理時間對卵母細胞卵裂率和囊胚率的影響，并使用6-DMAP、CB、CHX先聯(lián)合處理4h后，再用CHX單獨作用2h的新方法對豬卵母細胞

3、進行激活。 結(jié)果表明：（1）春季采集的屠宰卵巢卵母細胞經(jīng)體外成熟后孤雌激活，卵裂率和囊胚率最高，分別為79．70％和36．45％，極顯著高于夏季和冬季（63．90％，16．80％；69．48％，20．13％，P<0．01）；秋季雖然卵裂率顯著低于春季，但囊胚率與春季差異不顯著（P<0．05）；（2）當Ca2+濃度較低時（0．01、0．05 mmol/L），卵裂率和囊胚率都隨搭配脈沖強度的升高而升高，0．05 mmol/L、1．6

4、kV/cm與0．1 mmol/L、1．2kV/cm組卵裂率和囊胚率都極顯著高于其余各組分別為73．75％；37．50％和74．74％；36．83％（P<0．01）；當Ca2+濃度過高時（0．5 mmol/L），無論搭配何種強度DC，其卵裂率和囊胚率都降低。（3）施加連續(xù)兩次15μs，1．2kV/cm的直流脈沖，卵裂率和囊胚率與施加一次30gs同樣脈沖強度結(jié)果相同，都顯著高于施加連續(xù)兩次30gs的直流脈沖；以兩次間隔30min強度為1．2

5、kV/cm的直流脈沖進行電激活，卵裂率和囊胚率都顯著低于一次30μs直流脈沖；（4）以山梨醇為基本組分的電激液進行電激活，卵裂率、囊胚率先隨脈沖強度的升高而升高，在1．6kV/cm時，卵裂率和囊胚率達到最高，分別為77．23％和34．15％，極顯著高于1．0kV/cm和1．2kV/cm（P<0．01）；與1．4kV/cm差異不顯著（P>0．05）。但隨著脈沖強度進一步升高，孤雌發(fā)育能力明顯下降；（5）與甘露醇電激液不同，直流脈沖前施加交

6、流電，山梨醇液不能對孤雌胚胎發(fā)育起到促進作用；（6）將山梨醇、甘露醇電激液等體積混合，交流脈沖后進行電激活，1．2、1．6kV/cm組卵裂率分別72．33％和70．03％，囊胚率分別為31．03％和29．60％，雖然略低于甘露醇組（77．07％，36．03％），但優(yōu)于山梨醇組（69．63％，27．93％），差異不顯著（P>0．05）。（7）電激后分別使用6-DMAP處理4h、CB處理4h、CHX處理6h能達到最佳激活效果，卵裂率和囊胚率

7、分別為70．30％，32．68％；71．92％，30．14％和59．58％，19．16％；（8）6-DMAP、CB和CHX聯(lián)合處理無論4h或6h，還是先聯(lián)合處理4h再由CHX單獨處理2h（4h+2h），卵裂率都極顯著高于三種化學(xué)藥物單獨處理（P<0．01）；4h+2h對卵的激活效果與聯(lián)合處理4h的處理效果相當；雖然卵裂率顯著低于聯(lián)合處理6h（P<0．05），但囊胚率極顯著高于處理6h，分別為41．24％，35．60％（P<0．01）；并

8、且有接近一半的卵裂卵發(fā)育至囊胚。 以上結(jié)果說明：春季和秋季為采集屠宰卵巢收集卵母細胞的最佳時間，這些時期采集的屠宰卵巢卵母細胞經(jīng)體外成熟后，孤雌激活發(fā)育能力強；夏冬兩季采集豬卵巢卵母細胞不適合用于體外培養(yǎng)。電激液中Ca2+濃度和脈沖強度低，卵激活效率低；Ca2+濃度和脈沖強度高，卵激活后發(fā)育效果可能會受到抑制。連續(xù)多次脈沖只引起一次豬胞內(nèi)Ca2+濃度升高，一次卵細胞內(nèi)Ca2+濃度升高就足以激活豬體外成熟卵母細胞；采用兩次間隔30

9、min的直流脈沖，不適合用于激活體外成熟卵母細胞。山梨醇液能夠取代甘露醇液用于豬卵細胞的電激活；同時以山梨醇和甘露醇作為電激液的基本成分，可以用于豬卵母細胞的電激活或融合。電激后再使用化學(xué)試劑繼續(xù)激活，6-DMAP激活效以處理4h最好，CB激活效果以處理4h最好，CHX激活效果以處理6h最好。6-DMAP、CB、CHX先聯(lián)合處理4h再由CHX單獨處理2h，有較好的激活效果，可以作為體外成熟豬卵母細胞人工激活的方式。 總之，在春秋