辛伐他汀誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的線(xiàn)粒體通路及調(diào)節(jié)機(jī)理研究.pdf

1、目的： 1．觀察辛伐他汀對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制和凋亡作用。 2．觀察辛伐他汀誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的線(xiàn)粒體通路相關(guān)物質(zhì)變化。 3．探討K562細(xì)胞凋亡的線(xiàn)粒體通路調(diào)節(jié)機(jī)理。 方法： 1．MTT法檢測(cè)辛伐他汀作用K562細(xì)胞后的增殖抑制率。 2．光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 3．流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率、線(xiàn)粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>和ROS濃度變化。

2、 4．分光光度法檢測(cè)辛伐他汀作用后K562細(xì)胞內(nèi)Caspase-3，8，9酶活性、總NO及GSH水平。 5．caspase-9與總NO抑制劑分別阻斷caspase-9和總NO，以推測(cè)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。 6．RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因D28K、iNOS、Bcl-2、Bax和Caspase-3，8，9。 7．免疫組化法和Westem blot技術(shù)檢測(cè)cytoC蛋白。 結(jié)果： 1．MTT結(jié)果顯示：20μmo

3、l/L辛伐他汀作用于K562細(xì)胞12h、24h、48h和72h細(xì)胞增殖抑制率分別為0.00％，21.02％，58.33％，74.78％。 2.2μmol/L辛伐他汀作用K562細(xì)胞48h，細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，包括核固縮、核碎裂和凋亡小體形成等。 3.20μmol/L辛伐他汀作用K562細(xì)胞12h、24h、48h和72h，細(xì)胞凋亡率變化分別為(2.55±0.26％)％，(6.1±0.35)％，(14.15±0.

4、42)％，(30.70±0.65)％；24～72h期間，處理組與對(duì)照組的凋亡率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4．辛伐他汀作用K562細(xì)胞24～72h，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞百分比增加，S期細(xì)胞百分比減少，細(xì)胞阻滯于G<,0>/G<,1>期。 5.24～72h期間，處理組K562細(xì)胞Caspase-3，8，9活性增加，48h活性最大，處理與對(duì)照組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 6．24

5、h時(shí)藥物處理組細(xì)胞內(nèi)總NO濃度開(kāi)始升高，隨作用時(shí)間增加細(xì)胞內(nèi)總NO濃度增大，48～72h處理組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 7．處理組細(xì)胞內(nèi)GSH(谷光苷肽)在12～72h期間降至較低水平，與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 8．熒光染料Fluo-3AM檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，處理組細(xì)胞Ca2+濃度均升高，峰值時(shí)間為12h，不同時(shí)間處理組與對(duì)照組相比Ca<'2+>濃度顯著

6、升高(P<0.05)。 9. 12h、24h、48h和72h處理組細(xì)胞MMP(線(xiàn)粒體膜電位)百分率降低分別為(0.7±0.24)％，(39.6±4.80)％， (24.4±2.45)％， (6.7±1.62)％，24～72h期間處理組的MMP與對(duì)照組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 10.熒光染料2′，7′-二氯熒光乙酰乙酸(2’，7’dichloro fluorescein diacetate，DCFH-DA)檢測(cè)

7、處理組K562細(xì)胞內(nèi)ROS(活性氧)濃度均升高，峰值時(shí)間為24h，與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 11．處理組與加入caspase-9抑制劑的處理組之間比較，K562細(xì)胞凋亡率和數(shù)目無(wú)顯著變化(P>0.05)。 12．處理組與加入總NO抑制劑的處理組之間比較，NO抑制劑組的細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著性變化(P>0.05)；細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。 13．24～72h期間處理組的Apaf-

8、1、D28K、iNOS、Bax和Caspase-3，8，9基因表達(dá)均不同程度上調(diào)；Bcl-2基因均不同程度下調(diào)；與對(duì)照組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 14．western blot和免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：24～72h期間處理組細(xì)胞內(nèi)cytoC蛋白均增加，與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 1．20μmol/L辛伐他汀能抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用具有時(shí)間依賴(lài)