低頻脈沖磁場調(diào)節(jié)NO-ONOO-對缺氧復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞的影響.pdf

1、研究背景
　　急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)是由于冠狀動脈閉塞、血流量急劇減少,導(dǎo)致相應(yīng)心肌組織缺血缺氧,引起細(xì)胞能量代謝障礙和功能失調(diào),救治不及時可能產(chǎn)生嚴(yán)重的心肌損傷甚至猝死。目前AMI治療手段通常采取介入治療或溶栓治療盡快打開閉塞血管,恢復(fù)冠狀動脈血流,挽救存活的心肌。然而,缺血/再灌注(ischemiareperfusion,I/R)和無復(fù)流(no-reflow,NR)造成的心肌

2、損傷是缺血性心臟病治療過程中的重要問題[1]。尋求一種積極有效地保護(hù)性治療措施,抑制或減輕開通閉塞冠狀動脈產(chǎn)生I/R和NR所致的心肌損傷,具有重要的臨床意義。
　　磁場的生物學(xué)效應(yīng)愈來愈受到人們的重視,研究發(fā)現(xiàn)磁場通過不同的機(jī)制可使分子細(xì)胞、組織器官甚至整個機(jī)體發(fā)生形態(tài)和功能的改變[2]。研究顯示:磁場具有抗炎、抗氧化、抗血栓、促進(jìn)一氧化氮(NO)生成等生理效應(yīng),并能抑制主動脈內(nèi)粥樣斑塊的形成,還可促進(jìn)缺血心肌組織的血管修復(fù)與新生

3、[3-5],并能有效抑制I/R導(dǎo)致的大鼠心肌損傷,進(jìn)而改善心臟功能[6-8]。然而,關(guān)于磁場對I/R引起的心肌細(xì)胞損傷保護(hù)機(jī)制機(jī)理尚不清楚。
　　因此,我們對磁場、NO、氧化應(yīng)激與心肌缺血的關(guān)系進(jìn)行梳理,本實驗旨在觀察低頻脈沖磁場(LF-PMFs)對缺氧/復(fù)氧(H/R)條件下SD乳鼠心肌細(xì)胞的影響,研究一氧化氮/過氧亞硝基陰離子(NO/ONOO-)及通路在磁場對H/R條件下心肌細(xì)胞損傷中的地位與作用,并進(jìn)一步探討磁場的保護(hù)機(jī)制。<

4、br>　　研究目的
　　1.觀察不同參數(shù)LF-PMFs對H/R條件下乳鼠心肌細(xì)胞增殖與凋亡的影響,篩選出最佳磁場。
　　2.觀測LF-PMFs對H/R的心肌細(xì)胞NO/ONOO-及其通路的影響,研究探討磁場作用的保護(hù)機(jī)制與NO/ONOO-之間的關(guān)系。
　　實驗方法
　　采用酶消化法分離SD乳鼠心肌細(xì)胞,差速貼壁法提純心肌細(xì)胞,運用形態(tài)學(xué)和免疫組化染色法(cTnI)鑒定心肌細(xì)胞,MTT比色法測繪心肌細(xì)胞生長曲線;建立

5、SD乳鼠心肌細(xì)胞的H/R模型,缺氧與復(fù)氧的時間分別為3h;選取磁場參數(shù):磁場為矩形波,頻率為15Hz、20Hz,磁場強(qiáng)度為1.5mT、3.0mT、4.5mT、6.0mT;作用時間分別為1h、3h、5h。
　　將SD乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組:(1)對照組(Control):常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞,不做任何干預(yù);(2)H/R組:心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧和復(fù)氧處理;(3)磁場組:在心肌細(xì)胞缺氧前用LF-PMFs干預(yù),觀察磁場對心肌細(xì)胞損傷的預(yù)防作用,

6、復(fù)氧后用LF-PMFs干預(yù)以觀察磁場對損傷心肌細(xì)胞的治療效果。
　　心肌細(xì)胞進(jìn)行H/R和LF-PMFs干預(yù)后,用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞的凋亡程度,MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖活性,觀察比較不同LF-PMFs對H/R條件下心肌細(xì)胞的影響,篩選出最佳磁場參數(shù);然后用最佳磁場和H/R作用心肌細(xì)胞后,WST-1法和免疫組化染色法(Dihydroethidium,DHE)檢測O2￣,Griess法測定NO和ONOO-,化學(xué)發(fā)光法檢測NADP

7、H氧化酶活性;免疫印跡法(WesternBlot)檢測eNOS磷酸化水平。
　　實驗結(jié)果
　　1.在H/R條件下,LF-PMFs可促進(jìn)乳鼠心肌細(xì)胞增殖,抑制其凋亡;4.5mT、15Hz作用時間3h的磁場保護(hù)效果顯著。
　　2.LF-PMFs可減少H/R損傷的心肌細(xì)胞O2￣含量:對照組(0.267±0.049μmol/L)、LF-PMFs+H/R組(0.326±0.055μmol/L)和H/R+LF-PMFs(0.324

8、±0.056μmol/L)組O2￣生成較H/R組(0.401±0.116μmol/L)明顯減少(P<0.05),提示LF-PMFs能抑制H/R乳鼠心肌細(xì)胞O2￣的生成。
　　3.LF-PMFs對H/R損傷的乳鼠心肌細(xì)胞NO及ONOO-生成的影響:H/R組(3.15±1.06μmol/L)較對照組(5.74±2.26μmol/L)和磁場組(4.52±1.95μmol/L、4.58±1.60μmol/L)NO生成明顯減少(P<0.05

9、),而H/R組(27.42±5.74μmol/L)較對照組(18.12±4.08μmol/L)和磁場組(21.67±5.45μmol/L、20.85±5.77μmol/L)ONOO-生成明顯增加(P<0.05),磁場組間無明顯差別(P>0.05);H/R組NO/ONOO-比值較磁場組明顯降低(P<0.05),磁場組間無顯著差異(P>0.05)。
　　4.化學(xué)發(fā)光法檢測NADPH氧化酶活性:與H/R組比較,磁場組能顯著降低H/R損傷

10、的乳鼠心肌細(xì)胞NADPH氧化酶活性(P<0.05)。
　　5.WesternBlot檢測心肌細(xì)胞eNOS磷酸化水平:磁場可增加心肌細(xì)胞eNOS磷酸化表達(dá),對H/R損傷的乳鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用(P<0.05);磁場組間無顯著差別(P>0.05)。
　　結(jié)論
　　1.H/R損傷的SD乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過15Hz4.5mT的矩形波LF-PMFs干預(yù)3h,顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖活性并抑制其凋亡程度。
　　2.磁場對H/R損傷