自身免疫性疾病抗體檢測芯片診斷產(chǎn)品開發(fā)研究.pdf

1、自身免疫性疾病(Autoimmunedisease，AID)是指機(jī)體免疫系統(tǒng)對自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生自身抗體及(或)自身致敏淋巴細(xì)胞，攻擊自身靶抗原和組織，使其產(chǎn)生病理改變和功能障礙而導(dǎo)致的疾病。近年來，AID的發(fā)病率呈明顯上升，約占世界總?cè)丝诘?～5％，我國患者超過1200萬。自身抗體是AID最重要的特征，對AID的診斷和鑒別診斷、病情評估、病程轉(zhuǎn)歸與預(yù)后判斷等都具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。 目前臨床上開展的自身抗體檢測方法主

2、要有間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法、免疫斑點(diǎn)法等，其中多數(shù)檢測方法仍以手工操作為主，檢測程序較復(fù)雜，不能同時(shí)檢測多種自身抗體，給臨床檢測帶來較多的麻煩，同時(shí)檢測成本也高。蛋白芯片具有的高通量、平行檢測、自動化等優(yōu)點(diǎn)，為簡便、快速、同時(shí)檢測多種自身抗體的解決帶來了希望。目前已報(bào)道的蛋白芯片的檢測方法大部分是采用熒光檢測。該方法雖然靈敏度較好，但需要專用的掃描儀，使應(yīng)用受到了限制。 NBT/BCIP顯色方法是一種常用的、

3、穩(wěn)定的檢測系統(tǒng)，在實(shí)驗(yàn)室和臨床上應(yīng)用廣泛。而該顯色方法在蛋白芯片中的應(yīng)用至今還沒有相關(guān)的報(bào)道，因此，有必要將這種常用的檢測方法和新的蛋白芯片技術(shù)體系結(jié)合，開發(fā)適用于不同級別臨床需要的簡便、快速、可同時(shí)檢測多種自身抗體的蛋白芯片技術(shù)體系。 目的： 選擇臨床上常用的用于自身免疫性疾病抗體檢測所對應(yīng)的12種抗原，運(yùn)用NBT/BCIP顯色反應(yīng)策略，對芯片的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，研制一種可同時(shí)檢測12種自身抗體的蛋白芯片技術(shù)體系。

4、 方法： 1.抗原的選擇、制備 選擇臨床上常用的用于自身免疫性疾病抗體檢測所對應(yīng)的12種抗原，自行制備核抗原和雙鏈DNA(dsDNA)，CCP采用商業(yè)合成，其余抗原從公司購買。 2.玻片的選擇和制備 采用我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的并得到專利授權(quán)的APES修飾的玻片作為點(diǎn)樣的基片并制備。 3.抗原點(diǎn)樣液、點(diǎn)樣濃度、血清稀釋度的優(yōu)化及蛋白芯片cutoff值的確定 運(yùn)用NBT/BCIP顯色反應(yīng)策略

5、，對每一種抗原的點(diǎn)樣液、點(diǎn)樣濃度、血清稀釋度進(jìn)行優(yōu)化，確定所制備蛋白芯片的陽性Cu。toff值和陰性Cu‘toff值。 4.蛋白芯片敏感度和特異度的評價(jià)： 用我們研制的顯色反應(yīng)蛋白芯片對臨床血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，評估蛋白芯片對每種自身抗體檢測的敏感度和特異度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。 結(jié)果： 1.抗原的選擇、制備 我們針對臨床常見的AID的檢測需要，和目前可以獲得的抗原，確定的12種抗原分別是ANA，Ro-

6、60/SSa，La/SSb，Jo-1，Scl-70，Sm，Ro-52/SSa，RF，CCP，ulRNP，CENP-B和dsDNA。以自行提取的Hep-2細(xì)胞核蛋白作為檢測ANA的核抗原，提取人基因組dsDNA作為檢測抗dsDNA抗體的抗原，CCP采用商業(yè)合成，其余抗原從公司購買。 2.玻片的選擇和制備 按照我們的專利技術(shù)，制備APES修飾玻片作為點(diǎn)樣的基片。 3.抗原點(diǎn)樣液、點(diǎn)樣濃度、血清稀釋度的優(yōu)化及蛋白芯片c

7、utoff值的確定 優(yōu)化出的點(diǎn)樣液為0.1％TBST:12種抗原的點(diǎn)樣濃度分別為：ANA520μg/ml，Ro-60/SSa465μg/ml，La/SSb530μg/ml，Jo-1530μg/ml，Scl-70525μg/ml，Sm520μg/ml，Ro-52/SSa615μg/ml，RF340μg/ml，CCP-465μg/ml，ulRNP410μg/ml，CENP-B490μg/ml，dsDNA580μg/ml；血清稀釋度為

8、1:4；陽性對照Ⅱ?yàn)?50μg/mlHumanIgG，也即芯片的陽性cutoff值；陰性對照為5μg/mlHumanIgG，也即芯片的陰性cutoff值；陽性對照I為500μg/mlHumanIgG，作為強(qiáng)陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)和芯片的質(zhì)控區(qū)。 4.蛋白芯片敏感度和特異度的評價(jià)： 應(yīng)用我們的顯色反應(yīng)蛋白芯片技術(shù)體系和方法，對12種自身抗體的檢測敏感度分別為：ANA93.1％，抗Ro-60/SSa抗體81.4％，抗La/SSb抗體

9、91.1％，抗Jo-1抗體81.0％，抗Scl-70抗體84.5％，抗Sm抗體93.5％，抗Ro-52/SSa抗體90.8％，RF90.1％，抗CCP抗體91.2％，抗ulRNP抗體96.3％，抗CENP-B抗體80.9％，抗dsDNA抗體80％；特異度分別為：ANA93.3％，抗Ro-60/SSa抗體98.3％，抗La/SSb抗體100％，抗Jo-1抗體95.8％，抗Scl-70抗體97.5％，抗Sm抗體89.2％，抗Ro-52/SS

10、a抗體95.0％，RF86.7％，抗CCP抗體90.8％，抗ulRNP抗體96.7％，抗CENP-B抗體95.0％，抗dsDNA抗體98.3％。蛋白芯片檢測結(jié)果與目前采用的單個(gè)抗體檢測方法的檢測結(jié)果無顯著性差異，兩者的符合率分別為ANA93.2％，抗Ro-60/SSa抗體93.9％，抗La/SSb抗體97.1％，抗Jo-1抗體92.0％，抗Scl-70抗體93.2％，抗Sm抗體90.7％，抗Ro-52/SSa抗體93.5％，RF88.1