小鼠睪丸支持細(xì)胞和胰島共培養(yǎng)的試驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，糖尿病患病率在世界各國急劇上升，成為嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全的主要疾病。如何攻克這一世界性難題，消除患者的痛苦已逐漸成為全球性問題。國內(nèi)外從各個(gè)方面進(jìn)行了研究，除了藥物治療以外，胰島移植是治療胰島素依賴型糖尿病的有效方法之一，故而成為國內(nèi)外研究、攻克的重點(diǎn)。如何分離、純化足夠數(shù)量和最佳質(zhì)量的胰島，有效延長(zhǎng)胰島的體外存活時(shí)間以及消除胰島移植后的免疫排斥反應(yīng)，是當(dāng)前胰島移植治療糖尿病面臨的一大難題。睪丸支持細(xì)胞(sertolice

2、ll,SC)是睪丸組織中支持生精過程的關(guān)鍵細(xì)胞，同時(shí)具有營養(yǎng)、支持、分泌、吞噬和免疫豁免等重要的功能。針對(duì)目前胰島移植和睪丸支持細(xì)胞的研究現(xiàn)狀，本試驗(yàn)先開展和優(yōu)化了小鼠胰島和睪丸支持細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)方法的研究，然后將不同數(shù)量的睪丸支持細(xì)胞和胰島在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，從而探求睪丸支持細(xì)胞為胰島提供新的微環(huán)境，保持胰島的良好功能，有效延長(zhǎng)胰島的體外存活時(shí)間，為胰島移植的廣泛應(yīng)用提供理論和技術(shù)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械分離和膠

3、原酶兩步消化法對(duì)小鼠胰島進(jìn)行分離，并采用濾網(wǎng)過濾、聚蔗糖(Ficoll-400)密度梯度離心、24h轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)對(duì)分離的胰島進(jìn)行純化，熒光顯微鏡觀察胰島培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，熒光免疫法測(cè)定胰島素分泌量；采用胰蛋白酶和膠原酶分步消化方法從小鼠睪丸中分離睪丸支持細(xì)胞，然后用1/3Hanks低滲液對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行低滲處理，培養(yǎng)至24h再用50mmol/L、pH為7.1的Tris-HCL液純化處理，應(yīng)用HE染色和油紅O染色方法觀察睪丸支持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)

4、和生物學(xué)特性；用不同數(shù)量的睪丸支持細(xì)胞與胰島共同培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察胰島培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，熒光免疫法和比色法測(cè)定胰島素分泌量和胰淀粉酶的含量，獲得如下研究結(jié)果。 1.分離純化后平均每只小鼠能獲取642±57個(gè)胰島(IEQ單位)，約有85％的胰島直徑在100～300μm之間，為符合移植要求的胰島，經(jīng)雙硫腙(DTZ)特異性染色鑒定，純度為90％，臺(tái)盼蘭染色結(jié)果顯示活率在90％以上。在用膠原構(gòu)建的細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)的胰島能夠長(zhǎng)期維持良好

5、的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胰島素分泌能力和糖刺激反應(yīng)性均超過對(duì)照組(刺激指數(shù)分別為3.31±0.21，1.95±0.17)。 2.經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶分步消化，1/3Hanks低滲液和Tris-HCL液純化處理，平均每個(gè)睪丸可獲得4×105個(gè)睪丸支持細(xì)胞，細(xì)胞的純度可達(dá)90％，活細(xì)胞占總數(shù)95％。 3.胰島單獨(dú)培養(yǎng)至8天時(shí)，胰島數(shù)目明顯減少，胰島出現(xiàn)萎縮，并出現(xiàn)中央壞死，存活率明顯下降，培養(yǎng)2周后，大部分胰島細(xì)胞團(tuán)缺乏正常結(jié)構(gòu)，胰島素基

6、礎(chǔ)分泌量及對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)性顯著下降；胰島與睪丸支持細(xì)胞共同培養(yǎng)19d后，依然保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，未見細(xì)胞萎縮退化改變，并且具有旺盛的胰島素分泌功能，對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)性良好。同時(shí)外分泌腺細(xì)胞活性鑒定結(jié)果顯示，共同培養(yǎng)組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)胰淀粉酶含量迅速下降，其檢測(cè)值于第¨天時(shí)即達(dá)到最低限。表明睪丸支持細(xì)胞能夠促進(jìn)胰島迅速增殖，抑制外分泌部細(xì)胞，使胰島快速純化，保持較高的純度。同時(shí)顯示，1×106個(gè)睪丸支持細(xì)胞和100個(gè)胰島當(dāng)量(IE