應用基因標記技術探討混合造血干細胞移植后過繼免疫治療療效的研究.pdf

1、異體造血干細胞移植(allo-HSCT)因具有移植物抗白血病(GVL)效應，移植后復發(fā)率低；但移植物抗宿主病(GVHD)及感染等并發(fā)癥發(fā)生率高，致使移植相關死亡率高，且由于存在HLA配型相合問題，大部分患者無行異體造血干細胞移植治療的可能，致使臨床應用受限。 白體造血干細胞移植(auto-HSCT)開展己近40年。它雖不受配型限制，并發(fā)癥較輕，但因缺乏GVL效應而復發(fā)率較高。復發(fā)是自體造血干細胞移植失敗的重要原因，減少復發(fā)成為提

2、高療效的關鍵。 我們以往的研究證明，以自體為主，混合HLA半相合異體造血干細胞的干細胞移植(混合造血干細胞移植，mixed-HSCT)可在一定程度上兼有兩者的優(yōu)點，克服其不足，誘導形成混合嵌合體，減輕GvHD，同時保留GVL效應。 鑒于此，本課題從動物實驗入手，應用含有標記基因的K562細胞和BALB/C小鼠制備白血病小鼠模型；應用基因標記技術進行動物實驗，探討以自體為主，混合H-2半相合異體造血干細胞的干細胞移植(即混

3、合造血干細胞移植)及移植后應用供體淋巴細胞輸注聯合IL-2治療急性髓性白血病的療效和嵌合體形成情況，為臨床應用提供依據；并應用于臨床實踐，觀察該方法對成人急性髓性白血病的治療效果。 1.研究內容及方法： (1)K562細胞株的基因轉移：培養(yǎng)PA317-GCGPXSN和NIH3T3及K562細胞株；應用PA317-GCGPXSN細胞株制備病毒上清，NIH3T3細胞株測定病毒滴度；應用rhIL-3、rhIL-6及rhSCF刺

4、激K562細胞株后，實施基因轉移；應用流式細胞儀測定基因轉移效率及PCR方法測定NeoR基因，將完成基因轉移的K562細胞株命名為K562+細胞株。 (2)BALB/C小鼠模型制備：SPF級BALB/C小鼠按實驗分組后分別經直線加速器照射2GY和3GY，24小時后取對數生長期的K562+細胞按實驗分組以尾靜脈一次性注射K562+細胞。觀察小鼠的一般情況及生存時間、骨髓細胞分類及外周血白細胞計數、分類、細胞亞群及相關臟器病理檢查、

5、流式細胞儀測定K562+細胞、PCR方法測定組織浸潤情況。 (3)常規(guī)方法培養(yǎng)BALB/CxC57BLF1代小鼠骨髓細胞，并應用流式細胞儀測定T亞群及NK細胞，CD34+細胞。在經過PHA，rhIL-2，rhIL-3、rhIL-6及rhSCF刺激后實施基因轉移，應用流式細胞儀測定基因轉移效率，PCR方法測定NeoR基因。將完成基因轉移的F1代細胞命名為F1+細胞。 (4)動物實驗：用上述方法制備白血病小鼠模型，按實驗分組

6、。7天后做6Gy照射，照射后24小時做自體骨髓移植或混合骨髓移植，混合移植間隔1小時。混合移植組每7天輸F1代細胞一次，應用IL-2者隔同腹腔注射一次。觀察4周后殺死存活小鼠，做外周血及骨髓細胞形態(tài)檢查，細胞亞群測定，GFP+細胞測定，NeoR基因測定，肝臟、脾臟病理學檢查及組織勻漿細胞的GFP+細胞和NeoR基因的測定。 (5)13例急性髓性白血病患者在完全緩解期實施了Mixed-HSCT，于造血恢復后，給予DLI聯合IL-2

7、治療2-7次：另有11例急性髓性白血病患者在同樣條件下實施Mixed-HSCT，移植后未予特殊治療。 2.實驗結果： (1)K562細胞基因轉移效率K562-細胞應用流式細胞儀測定的熒光強度數值為0.56％，K562+細胞熒光強度為77.16％。兩者差異顯著(P＜0.01)。PCR方法擴增到了NeoR基因的特異性片斷，說明含GFP和NeoR基因的逆轉錄病毒載體質粒已轉移并整合進入K562細胞的基因組中。 (2)白

8、血病模型制備情況 ①照射對小鼠免疫功能的影響E組小鼠經2Gy照射后外周血CD3、CD4、CD8、CD16+CD56+細胞呈進行性降低，至第3周開始出現逐漸恢復跡象，4周后恢復正常。F組在3GY照射后CD3、CD4、CD8、CD16+CD56+細胞呈進行性降低，至第4周開始出現逐漸恢復跡象，5周后恢復正常。在同一時間，3GY照射較2GY照射所導致的細胞亞群降低的程度更為明顯(P＜0.05)。脾、胸腺在照射后外觀較正常小鼠縮小，重量

9、減輕并延續(xù)至4周才基本恢復至照射前的水平，肝臟重量無明顯變化。 ②發(fā)病情況照射2、3GY后未接種K562+細胞的BALB/C小鼠(E、F組)觀察4周未出現自然死亡。照射2、3GY后分別接種K562+細胞2×106、5×106的BALB/C小鼠(A、B、C、D組)在接種5-7天時發(fā)病。A組于30天內全部死亡；C組于24天內全部死亡；B組于23天內全部死亡；D組于17天內全部死亡；各組小鼠生存天數有顯著性差異，均顯著短于正常對照組(

10、P＜0.01)。體重均較正常對照組顯著下降(P＜0.01)。小鼠的白血病發(fā)病率為100％，無自發(fā)緩解。隨著接種白血病細胞數量的增加和照射劑量的增加，小鼠的存活時間逐漸縮短，且外周血及骨髓中人原、早幼粒白血病細胞所占比例逐漸增加。病理學檢查證實有腫瘤細胞浸潤。流式細胞儀測定結果與此相一致，PCR方法也證實了NeoR基因的存在。 (3)F1代細胞基因轉移效率F1(-)細胞應用流式細胞儀測定的熒光強度數值為0.63％，F1(+)細胞熒

11、光強度為76.04％。兩者差異顯著(P＜0.001)。PCR方法擴增到了NeoR基因的特異性片斷，說明含GFP和NeoR基因的逆轉錄病毒載體質粒已轉移并整合進入F1(+)細胞的基因組中。 (4)小鼠骨髓移植實驗 ①骨髓移植細胞數目測定實驗組小鼠移植白體骨髓細胞中，CD34+細胞為1.32％，CD3+細胞26.56％,CD4+細胞13.44％，CD8+細胞3.09％，CD16+CD56+細胞7.53％。移植異體骨髓細胞(F

12、1+)中，CD34+細胞為1.51％，CD3+細胞61.41％，CD4+細胞39.57％，CD8+細胞27.61％，CD16+CD56+細胞9.59％；移植異體骨髓細胞(F1-)中，CD34+細胞為1.49％，CD3+細胞65.86％，CD4+細胞40.13％，CD8+細胞19.16％，CD16+CD56+細胞9.70％；其中F1(+)與F1(-)細胞各亞群之間沒有明顯差別(P＞0.05)，即每只實驗鼠所移植的各類細胞數目沒有明顯差別。

13、 ②各實驗組療效觀察白血病小鼠模型組(A組)在20天內全部死亡，白血病小鼠模型經6GY照射后(F組)在14天內全部死亡，在瀕死小鼠骨髓及外周血中均檢測到GFP及NeoR基因。A組瀕死小鼠外周血及骨髓見11％-64％不等的原、幼稚細胞。F組瀕死小鼠外周血及骨髓細胞稀少，主要為淋巴細胞。A組和F組瀕死小鼠骨髓及外周血中均檢測到GFP及Neo基因的存在。兩組瀕死小鼠外周血T細胞亞群及NK細胞均極低。其它實驗組小鼠均有6-3只不等的小鼠

14、存活時間＞28天，存活的小鼠外周血及骨髓細胞數量及形態(tài)同正常小鼠，外周血T細胞亞群及NK細胞已恢復至正常范圍，各組之間無明顯差別(P＞0.05)。在存活小鼠中輸注F1(+)細胞者檢測到了GFP及Neo基因。存活小鼠肝、脾檢查未發(fā)現腫瘤細胞在肝、脾組織中的浸潤及充血等現象。組織勻漿細胞的GFP和NeoR基因的測定中未檢測到GFP+細胞，亦未擴增到特異性的Neo基因片段的存在。證明K562+的腫瘤細胞在存活小鼠的肝、脾中消失。 (5

15、)臨床療效觀察混合造血干細胞移植患者均獲得造血重建。無GVHD發(fā)生。觀察組中有3例M2a患者在接受1、2、2次DLI+IL-2治療后+3、+4、+7月復發(fā)死亡。1例M2a患者接受2次DLI+IL-2治療后，于+1年時出現MDS，死于腦出血。1例M5患者應用DLI+IL-2治療1次后出現不明原因高熱、抽搐，死于癲癇持續(xù)狀態(tài)。其余8例患者隨訪1-5年均無病存活。其中1例M4、1例M5患者有嵌合體形成。長期生存率為61.5％(8/13例)。對

16、照組有2例M2a，2例M4，1例M5于移植后+1-+7月復發(fā)死亡，1例M3患者于+25天死于腦出血。其余2例M3，2例M4，1例M5隨訪3-5年均無病存活。其中后3例均有嵌合體形成。長期生存率為45.4％(5/11例)。 3.結論： (1)含有GFP基因和NeoR基因的逆轉錄病毒成功地轉移進入K562細胞株和BALB/C×C57BLF1代小鼠骨髓細胞中。 (2)BALB/C小鼠經照射后從尾靜脈注射K562細胞株可