人重組TRAIL治療膽囊癌的實驗研究.pdf

1、第一部分，人重組TRAIL誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡作用的研究
　　目的：研究人重組TRAIL(recombinant human TNF relatedapoptosis inducing ligand,rhTRAIL)對膽囊癌細(xì)胞株SGC-996和GBC-SD的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　方法：繪制不同濃度rhTRAIL作用于膽囊癌細(xì)胞株SGC-996和GBC-SD后生長曲線,計算半數(shù)抑制濃度(IC50);以相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察、凋

2、亡效應(yīng)蛋白酶Caspase3、7的活性檢測和流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI染色后凋亡細(xì)胞比例測定三種方法觀測細(xì)胞凋亡狀況。
　　結(jié)果：rhTRAIL作用于膽囊癌細(xì)胞株SGC-996和GBC-SD三天后的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為245.8ng/ml和270.2ng/ml;rhTRAIL作用后,膽囊癌細(xì)胞SGC-996、GBC-SD胞膜出現(xiàn)皺縮,凋亡效應(yīng)蛋白酶caspase3、7的活性明顯升高,細(xì)胞凋亡比例顯著上升。
　

3、　結(jié)論：rhTRAIL對膽囊癌細(xì)胞生長有抑制作用,其作用是通過誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的,且呈劑量依賴性。
　　第二部分，膽囊癌中c-FLIP的表達(dá)狀況及其對人重組TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響
　　目的：檢測人膽囊癌組織和細(xì)胞株中細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣白介素—1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellular Fas-associateddeathdomain-likeinterleukin-1convertingenzymeinh

4、ibitory protein,c-FLIP)的表達(dá)水平,了解c-FLIP表達(dá)狀況對rhTRAIL誘導(dǎo)的膽囊癌凋亡的影響。
　　方法：收集35例膽囊癌石蠟切片和同期10例膽囊腺瘤、10例正常膽囊組織的石蠟切片作為對照。以免疫組織化學(xué)鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化物酶(S—P)法半定量測定其c-FLIP表達(dá)狀況;化學(xué)合成法合成SiRNAc-FLIP干擾片斷,以抑制c-FLIP表達(dá);檢測SiRNA干擾c-FLIP表達(dá)聯(lián)合rhTRAIL作用

5、后,膽囊癌SGC-996和GBC-SD細(xì)胞凋亡狀況。
　　結(jié)果：c-FLIP在膽囊癌組織中陽性表達(dá)26/35(74.2％),顯著高于其在膽囊腺瘤組織2/10(20%)和正常膽囊組織中1/10(10%)的表達(dá)水平;SiRNA有效降低了c-FLIP表達(dá)水平;SiRNA干擾c-FLIP表達(dá)聯(lián)合rhTRAIL作用后,膽囊癌細(xì)胞凋亡狀況明顯高于對照各組。
　　結(jié)論：膽囊癌組織中,c-FLIP的表達(dá)明顯高于其在膽囊腺瘤和正常膽囊組織中的

6、表達(dá)。SiRNA可以有效抑制c-FLIP的表達(dá)水平,進而顯著增強rhTRAIL對膽囊癌的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　第三部分，人重組TRAIL聯(lián)合塞來昔布增強rhTRAIL誘導(dǎo)膽囊癌凋亡的作用研究及其機制探討
　　目的：經(jīng)體內(nèi)、外實驗觀察rhTRAIL聯(lián)合環(huán)氧化酶-2選擇性抑制劑塞來昔布對膽囊癌的療效,初步探討產(chǎn)生療效的機制。
　　方法：Western-blot檢測塞來昔布作用于膽囊癌細(xì)胞株后,c-FLIP和死亡受體DR4、D

7、R5表達(dá)狀況;rhTRAIL聯(lián)合塞來昔布作用于膽囊癌細(xì)胞株SGC-996后,細(xì)胞凋亡狀況檢測;建立裸鼠荷膽囊癌皮下移植瘤模型,聯(lián)合給藥兩周后,測定皮下移植瘤體積、瘤重,計算抑瘤率,分析組間差異。
　　結(jié)果：塞來昔布作用于SGC-996細(xì)胞后,下調(diào)了c-FLIPs表達(dá),上調(diào)了DR5表達(dá),且呈濃度和時間依賴性。rhTRAIL聯(lián)合塞來昔布作用于膽囊癌細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡水平明顯高于單獨用藥組和對照組;rhTRAIL聯(lián)合塞來昔布作用于荷膽囊癌

8、裸鼠皮下移植瘤,聯(lián)合用藥組移植瘤體積增長明顯受抑制(P<0.05):聯(lián)合用藥組抑瘤率(23.3%)高于rhTRAIL單藥組(14.3%)和塞來昔布單藥組(15.5%);但移植瘤瘤重測定顯示組間差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：塞來昔布通過下調(diào)c-FLIPs表達(dá)和上調(diào)DR5表達(dá),顯著增強了rhTRAIL誘導(dǎo)膽囊癌SGC-996細(xì)胞凋亡的作用。rhTRAIL聯(lián)合塞來昔布較單獨用藥組更能抑制荷膽囊癌裸鼠皮下移植瘤的生長,其