槲皮素通過(guò)TLR4-NF-κB信號(hào)調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種以炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)為主的慢性氣道炎癥性疾病，世界哮喘人口約有2億，最高發(fā)病率達(dá)到18％，而我國(guó)哮喘人口的發(fā)病率在0.5-1.5％，哮喘病人達(dá)到3000萬(wàn)。目前普遍認(rèn)為在哮喘的遺傳易感人群中，正常環(huán)境中的變應(yīng)原可引起機(jī)體的不適當(dāng)免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致哮喘氣道炎癥的發(fā)生與發(fā)展。其中，屋內(nèi)塵螨、內(nèi)毒素、病毒感染等因素在哮喘氣道炎癥中的作用受到了越來(lái)越多學(xué)者的

2、關(guān)注，這些環(huán)境中的變應(yīng)原可以與機(jī)體的主要模式識(shí)別受體結(jié)合，通過(guò)激活不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)出不同的基因表達(dá)模式，從而引起各種促炎因子的釋放，一方面誘導(dǎo)體內(nèi)各種抗原提呈細(xì)胞(APC)如樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的活化，激活體內(nèi)的內(nèi)源性免疫反應(yīng)，同時(shí)另一方面調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的分化，促進(jìn)特異性抗原誘導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展，誘導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。Toll樣受體(TLRs)是機(jī)體的一種重要的跨膜蛋白，在識(shí)別機(jī)體自身和異體抗原以及有害和無(wú)害的抗原

3、中起重要的作用，其中Toll樣受體4(TLR4)是屋塵螨(HDM)的主要模式識(shí)別受體。HDM通過(guò)激活TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使氣道內(nèi)DC活化，進(jìn)而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化，同時(shí)可促進(jìn)化學(xué)趨化因子及白細(xì)胞介素(IL)-25、IL-33、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等各種促炎因子的釋放，募集氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞，調(diào)節(jié)不同炎癥細(xì)胞的存活周期，從而在哮喘的氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　以槲

4、皮素為代表的黃酮類化合物，是一種常見(jiàn)的植物雌激素，廣泛存在于日常的多種蔬菜和水果中，如洋蔥、草莓、蘋果、藍(lán)莓等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，人們從日常的飲食中獲取的槲皮素日均攝入量大約為25 mg。目前大量的研究證明，槲皮素具有多種生物抗炎活性，在機(jī)體抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板聚集、降糖、調(diào)節(jié)血脂、擴(kuò)張血管等方面均有顯著的作用，已經(jīng)被認(rèn)為是最有前途的用于預(yù)防和治療炎癥相關(guān)性的慢性疾病的飲食藥物之一;然而，槲皮素對(duì)機(jī)體TLRs介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路引起

5、的炎癥反應(yīng)的是否有影響尚不明確，槲皮素的抗炎活性在減輕變態(tài)反應(yīng)性疾病如支氣管哮喘的氣道炎癥方面的機(jī)制有待于進(jìn)一步的闡明。因此，我們的課題研究著眼于槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化，進(jìn)而影響各種炎性因子的產(chǎn)生與釋放，從而進(jìn)一步明確對(duì)哮喘的氣道炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本研究擬運(yùn)用HDM誘導(dǎo)哮喘小鼠動(dòng)物模型，通過(guò)氣道上皮TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)DC活化，進(jìn)而檢測(cè)IL-25等各種促炎性因子的釋放，通過(guò)測(cè)定IL

6、-4，IL-5，IL-13等Th2淋巴細(xì)胞及IFN-γ等Th1淋巴細(xì)胞相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而進(jìn)一步明確固有性免疫和獲得性免疫反應(yīng)在哮喘炎癥中的重要作用，更加深入明確哮喘的病因和發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，應(yīng)用槲皮素干預(yù)后，觀察哮喘小鼠動(dòng)物模型中TLR4/NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及氣道內(nèi)各種炎癥細(xì)胞與炎癥因子的表達(dá)水平的變化。此外，本研究觀察了哮喘患者PBMCs中TLR4/NF-κBmRNA的表達(dá)及對(duì)炎癥因子釋放的影響，并觀察體外槲皮

7、素干預(yù)后上述指標(biāo)的變化，進(jìn)一步明確槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路在哮喘氣道炎癥中的作用機(jī)制。因此，本課題進(jìn)一步明確了TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的機(jī)體炎癥反應(yīng)機(jī)制，探討了槲皮素在調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路，影響機(jī)體T淋巴細(xì)胞分化，恢復(fù)Th1/Th2淋巴細(xì)胞平衡，改善炎癥因子的釋放，以及阻斷哮喘氣道炎癥的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程中的作用，可能為支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制研究以及治療方法提供新的更為有效的措施。
　　方法:

8、>　　第一部分:雌性BALB/c小鼠40只隨機(jī)分為A組（PBS對(duì)照組），B組(HDM哮喘模型組)和C組（HDM+槲皮素干預(yù)組），8-10周齡，體重(25±5)g，置于同一飼養(yǎng)室內(nèi)，通風(fēng)良好，自由飲水和攝食。A組在整個(gè)建模過(guò)程中給予PBS代替HDM進(jìn)行對(duì)照，B組用HDM提取液鼻內(nèi)滴入誘導(dǎo)建立小鼠哮喘模型，C組在建模的過(guò)程中給予槲皮素鼻內(nèi)滴入干預(yù)。用小鼠肺功能儀有創(chuàng)肺阻抗方法檢測(cè)小鼠的氣道反應(yīng)性變化，蘇木素伊紅(HE)染色方法觀察小鼠氣道及

9、肺組織炎癥浸潤(rùn)情況;細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中各細(xì)胞分類及計(jì)數(shù);酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)各組小鼠BALF上清中IL-25、IL-4，IL-5，IL-13，IFN-γ和GM-CSF的表達(dá);實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)方法測(cè)定小鼠氣道上皮TLR4mRNA和NF-κB(p65) mRNA的表達(dá)水平，免疫印跡方法(Western blotting)方法檢測(cè)小鼠肺組織中TLR4和NF-κB(p65)

10、蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)方法檢測(cè)DC表面CD80、CD86共刺激分子的表達(dá)。
　　第二部分:抽取20例急性發(fā)作期哮喘患者的外周靜脈血10 ml，各加入EDTA1.2 mL抗凝，按照密度梯度離心法分離出PBMCs，并分為兩份，一份加入槲皮素和PHA培養(yǎng)24h（槲皮素組），另一份僅加入PHA培養(yǎng)24h（PHA對(duì)照組），培養(yǎng)后分別收集上清液及細(xì)胞沉渣，采用ELISA法測(cè)定上清液中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，RT-PCR方

11、法測(cè)定細(xì)胞沉渣中TLR4和NF-κB(p65) mRNA的表達(dá)強(qiáng)度。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化圖片采用Image-prol-plus軟件分析。
　　結(jié)果:
　　1.HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型臨床表現(xiàn)
　　以小鼠出

12、現(xiàn)明顯的煩躁不安，活動(dòng)頻繁，呼吸急促，腹肌抽搐，大、小便失禁，毛發(fā)豎起，部分小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，動(dòng)作遲緩等為HDM誘導(dǎo)哮喘動(dòng)物模型成功的標(biāo)志。
　　2.HE染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變
　　高倍光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)，A組未見(jiàn)炎性表現(xiàn)，B組小鼠炎癥表現(xiàn)明顯，氣道及肺組織周圍可見(jiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞為主的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮細(xì)胞脫落壞死，黏膜皺褶增多，黏液腺增生，管壁增厚，管腔狹窄等，C組小鼠的炎性表現(xiàn)明顯減輕，氣道及肺組織周圍炎

13、癥細(xì)胞減少，肺泡壁基本結(jié)構(gòu)完整。
　　3.有創(chuàng)肺阻抗方法檢測(cè)小鼠的氣道反應(yīng)性變化
　　各組小鼠的呼氣阻力基礎(chǔ)值之間無(wú)顯著差異，注射乙酰甲膽堿(mAch)激發(fā)后，與A組小鼠相比，B組小鼠呼氣阻力顯著增高(P＜0.05)，表明哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性明顯高于對(duì)照組小鼠，哮喘模型制備成功。與B組相比，C組小鼠的氣道反應(yīng)性均顯著下降(P＜0.05)。
　　4.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)小鼠BALF沉淀中炎癥細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
　　與A組相比，

14、B組小鼠BALF沉淀中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與B組相比較，C組小鼠小鼠的細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.ELISA方法檢測(cè)各組小鼠BALF上清中IL-25、IL-4，IL-5，IL-13，IFN-γ和GM-CSF的表達(dá)水平
　　與A組相比，B組BALF上清中IL-25、IL-4，IL-5，IL-13和GM-CSF的

15、表達(dá)水平均明顯增高，而IFN-γ表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與B組相比較，C組小鼠BALF上清中IL-25、TSLP、IL-4，IL-5，IL-13和GM-CSF的水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而IFN-γ水平均無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.qRT-PCR方法測(cè)定各組小鼠肺組織TLR4 mRNA的表達(dá)水平
　　與A組相比，B組小鼠肺組織中TLR4mRNA的表達(dá)

16、水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=7.251×10-6），與B組相比較，C組小鼠小鼠肺組織中TLR4mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=8.140×10-7)。
　　7.qRT-PCR方法測(cè)定各組小鼠肺組織NF-κB(p65) mRNA的表達(dá)水平
　　與A組相比，B組小鼠肺組織中NF-κB(p65) mRNA的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=8.748×10-7)，與B組相比較，C組小鼠肺組織中NF

17、-κB(p65) mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=2.194×10-6）。
　　8.Western blotting檢測(cè)各組小鼠肺組織TLR4蛋白的表達(dá)強(qiáng)度
　　與A組相比，B組小鼠肺組織中TLR4蛋白的表達(dá)強(qiáng)度顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=6.251×10-7)，與B組相比較，C組小鼠肺組織中TLR4蛋白的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=4.947×10-7)。
　　9.Western

18、blotting方法檢測(cè)各組小鼠肺組織NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與A組相比，B組小鼠肺組織中NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=8.013×10-7)，與B組相比較，C組和小鼠肺組織中NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=3.846×10-7)。
　　10.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC的CD80的表達(dá)水平
　　與A組相比，B組小鼠DC的CD80表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)

19、計(jì)學(xué)意義（p=7.935×10-7），與B組相比較，C組小鼠DC的CD80的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=5.902×10-7)。
　　11.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC的CD86的表達(dá)水平
　　與A組相比，B組小鼠DC的CD86表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=2.964×10-6），與B組相比較，C組小鼠DC的CD86的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=7.531×10-8)。
　　12.RT-PCR方

20、法測(cè)定哮喘患者PBMCs培養(yǎng)后細(xì)胞沉淀中TLR4 mRNA的表達(dá)強(qiáng)
　　槲皮素組PBMCs培養(yǎng)后的細(xì)胞沉淀中TLR4 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較PHA對(duì)照組均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　13.RT-PCR方法測(cè)定哮喘患者PBMCs培養(yǎng)后細(xì)胞沉淀中NF-κB(p65)mRNA的水平
　　槲皮素組PBMCs培養(yǎng)后的細(xì)胞沉淀中NF-κB(p65) mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較PHA對(duì)照組均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

21、P＜0.05)。
　　14.ELISA方法測(cè)定哮喘患者PBMCs培養(yǎng)后上清液中IL-6的表達(dá)水平
　　槲皮素組PBMCs培養(yǎng)后上清液中IL-6的表達(dá)水平分別較PHA對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　15.ELISA方法測(cè)定哮喘患者PBMCs培養(yǎng)后上清液中TNF-α的表達(dá)水平槲皮素組PBMCs培養(yǎng)后上清液中TNF-α的表達(dá)水平分別較PHA對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。