肝細胞生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞對移植顆粒脂肪存活率的影響.pdf

1、目的：1.了解大鼠骨髓間充質干細胞生物學特性及歸巢特征；2.通過重組腺病毒介導的人肝細胞生長因子基因轉染骨髓間充質干細胞，探討其轉染效率、目的基因的表達情況；3.探討攜帶有肝細胞生長因子基因的骨髓間充質干細胞對移植顆粒脂肪的新生血管和存活率的影響。 方法：1.采用密度梯度離心法分離、培養(yǎng)、擴增骨髓間充質干細胞，流式細胞儀檢測細胞增殖周期，傳代后的細胞成脂誘導。用Ad-GFP轉染第3代MSCs，25只Wistar大鼠隨機分為延遲復

2、蘇組(A組，10只)、即時復蘇組(B組，10只)、假燙組(C組，5只)：A、B兩組大鼠背部造成Ⅲ度30％燙傷，制備A組為延遲復蘇模型，B組為即時復蘇模型，同時制備C組為假燙模型，經股靜脈移植轉染Ad-GFP48h后的MSCs；24h，7d后取小腸、肝臟、腎臟、燙傷皮膚創(chuàng)緣等組織，快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察在體內的分布。2.取第3代大鼠MSCs，以不同感染強度(MOI)(50，100，150，200)的Ad-GFP轉染MSCs，轉染后

3、的48小時，流式細胞儀檢測轉染效率，篩選最佳感染強度。Ad-HGF以最佳感染強度轉染MSCs，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中HGF的表達。3.Wistar雌性大鼠150只，隨機分為五組：A組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG；B組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1 × 108pfuAd-HGF液：C組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1 × 106MSCs；D組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1× 106M

4、SCs(攜帶GFP基因)；E組顆粒脂肪1ml+0.4mlDMEM-LG+1 × 106MSCs(攜帶HGF基因)均勻震動5分鐘，移植于背部皮膚與肌肉之間。移植后3d、5d、7d、14d、28d、60d每組各取5只脫頸處死，沿被膜分離出移植物，測體積，并行HE、maaaon’s染色觀察病理改變，免疫組化法測定組織的HGF、CD34表達水平。 結果：1.MSCs體外分離培養(yǎng)擴增5代，細胞數(shù)可達(1～2)×1011個，表現(xiàn)為成纖維細胞

5、樣外觀和貼壁生長特性，細胞周期分析表明：G0/G1期細胞占79.3％，S+G2+M期細胞為21.7％，分離的細胞可以在誘導體系下向脂肪細胞分化；經股靜脈移植攜帶GFP基因的MSCs，24h后觀察，在延遲復蘇組燙傷皮膚組織創(chuàng)緣，小腸黏膜廣泛可見綠色熒光，而肝、肺等器官少見，即時復蘇組熒光以燙傷皮膚創(chuàng)緣分布為主，小腸黏膜較少，假燙組中綠色熒光分布以肝臟為主。延遲復蘇組小腸熒光強度明顯強于即時復蘇組和假燙組(P<0.05)，而延遲和即時復蘇組

6、皮膚創(chuàng)緣熒光強度又強于假燙組(P<0.05)。2.在Ad-GFP轉染MSCs48小時，GFP的表達明顯增強，熒光顯微鏡觀察可見明顯的綠色熒光，分別用不同的效價轉染細胞，48小時后流式細胞儀測定轉染率，結果顯示，病毒強度MOI=100時轉染率最高達86.4％；轉染HGF后MSCs對HGF表達48h達到高峰，以后隨時間開始降低。3.Ad-HGF轉染MSCs組的移植體中HGF表達3d呈強陽性，隨移植時間延長逐漸減弱，并且3d、5d、7d、14

7、d表達明顯強于其他組(P<0.05)，而28d、60d時與其他組相比沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Ad-HGF轉染MSCs組新生血管7d左右達高峰，14d后趨于平穩(wěn)，在5d、7d、14d、28d、60d血管數(shù)量多于其他組(P<0.05)。28d和60d時，Ad-HGF感染MSC組顆粒脂肪體積保持率明顯好于其他四組(P<0.05)。結論：1.骨髓間充質干細胞體外能向成脂分化；導入目的基因不會改變MSCs歸巢特性；2.重組腺病毒可介導肝細