GRP78單核苷酸多態(tài)性與鉛中毒的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、本課題首次將GRP78基因多態(tài)性與鉛中毒易感性聯(lián)系起來(lái)，尋找適用于中國(guó)漢族人群的鉛中毒易感性分子標(biāo)志物，以達(dá)到預(yù)防和控制職業(yè)性鉛中毒的目的。
　　 研究目的：
　　 1.探討GRP78基因SNPs等位基因、基因型、單倍型與鉛中毒易感性之間的關(guān)聯(lián)；
　　 2.探討GRP78基因多態(tài)性與環(huán)境鉛濃度二者對(duì)鉛中毒易感性影響的關(guān)系；
　　 3.探討GRP78基因多態(tài)性與血鉛、尿鉛以及鉛中毒癥狀體征之間的關(guān)聯(lián)。

2、>　　 研究方法：
　　 1.研究對(duì)象的確定
　　 根據(jù)《職業(yè)性慢性鉛中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》以及現(xiàn)場(chǎng)鉛塵檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)工種(不同工種作業(yè)環(huán)境鉛濃度不同)選擇相應(yīng)環(huán)境下的鉛中毒人群和未發(fā)生鉛中毒的正常人群分別作為病例組和對(duì)照組
　　 2.現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查
　　 2.1作業(yè)場(chǎng)所環(huán)境鉛塵采集。
　　 2.2職業(yè)性健康檢查現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行《鉛作業(yè)人員調(diào)查問(wèn)卷》的調(diào)查工作。
　　 2.3職業(yè)性健康檢查現(xiàn)場(chǎng)采集研究對(duì)象靜脈

3、血(5ml/人)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
　　 3.1利用石墨原子吸收法檢測(cè)鉛塵和血鉛濃度。
　　 3.2血液基因組DAN提取試劑盒提取外周血細(xì)胞DNA，并檢測(cè)DNA模板濃度。
　　 4.SNP位點(diǎn)的選擇和引物、探針設(shè)計(jì)
　　 結(jié)合GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)資料確定候選SNP位點(diǎn)。利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針，委托美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司合成。
　

4、　 5.TaqMan(R)探針?lè)ɑ瘜W(xué)熒光等位基因鑒別試驗(yàn)
　　 按照ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用說(shuō)明書(shū)和TaqMan(R)SNP GenetypingAssays試劑盒操作指引，在ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行等位基因鑒別試驗(yàn)。
　　 6.遺傳平衡性檢驗(yàn)和單倍型構(gòu)建
　　 檢驗(yàn)不同基因型的Hardy-Weinberg平衡吻合度，判斷選擇的研究對(duì)象SNP位點(diǎn)遺傳平衡性。
　

5、　 利用Haploview軟件檢測(cè)所測(cè)等位基因的連鎖不平衡性并構(gòu)建單倍型。
　　 7.關(guān)聯(lián)分析
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)GRP78不同SNP位點(diǎn)等位基因、基因型以及單倍型與鉛中毒的關(guān)聯(lián)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為α=0.05(雙側(cè))。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)、方差分析或秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)或logistic回歸分析，多因素非條件Logistic回歸校正混雜因素的影響。采用OR(odds ra

6、tio，OR)值作為聯(lián)系強(qiáng)度指標(biāo)，當(dāng)OR＞1表示該研究因素為鉛中毒的危險(xiǎn)因素；OR=1表示該研究因素對(duì)鉛中毒的發(fā)生沒(méi)有作用；OR＜1表示該研究因素為鉛中毒的保護(hù)因素。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.研究對(duì)象均衡性比較
　　 1.1本研究選擇2007～2009年間廣州市蓄電池行業(yè)1200名觸鉛作業(yè)人員作為初篩對(duì)象，共發(fā)放調(diào)查問(wèn)卷1200份，回收1085份，其中有效問(wèn)卷1047份，應(yīng)答率為87.3％。根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)選擇確

7、診為鉛中毒人群315例作為病例組，相應(yīng)工種未發(fā)生鉛中毒的正常人群315例作為對(duì)照組。
　　 1.2兩組人群均衡性比較：年齡、學(xué)歷、吸煙、收入、工作制、工作接觸高溫的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；工齡、性別、飲酒的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.工作場(chǎng)所環(huán)境鉛塵濃度檢測(cè)結(jié)果
　　 不同的車間檢測(cè)結(jié)果均有超標(biāo)現(xiàn)象，病例組與對(duì)照組鉛塵短時(shí)間接觸容許濃度(STEL)和時(shí)間加權(quán)平均容許濃度(TWA)，差

8、異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)超過(guò)衛(wèi)生限值的倍數(shù)高低分成鉛塵高濃度、中濃度、低濃度三種暴露組。高濃度組主要集中在焊接車間，中濃度組主要集中在裝配車間，低濃度組主要集中在分板車間。
　　 3.SNP位點(diǎn)確定及遺傳平衡性檢驗(yàn)
　　 本次研究選擇GRP78基因啟動(dòng)子區(qū)域和3'UTR區(qū)3個(gè)SNPs，分別為rs391957、rs16927997和rs17840761。HWE檢測(cè)所有SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡，P＞0.0

9、5，可以認(rèn)為所選的研究對(duì)象群體代表性較好。
　　 4.GRP78等位基因、基因型和構(gòu)建的單倍型在兩組人群中的分布情況
　　 4.1 GRP78等位基因分布情況
　　 4.2 GRP78基因型分布情況
　　 4.3 GRP78單倍型分布情況
　　 5.GRP78等位基因、基因型、單倍型與鉛中毒易感性的關(guān)聯(lián)分析
　　 5.1 GRP78等位基因與鉛中毒易感性的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，校正混雜因素影響

10、后，OR值為1.37，95％CI為(1.09，1.73)，P=0.007，提示C等位基因可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 5.2 GRP78基因型與鉛中毒易感性的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，rs391957位點(diǎn)CC基因型與TT基因型相比，P=0.044，OR值為0.71，95％CI為(0.51,0.99)，校正混雜因素影響后，OR=0.69，95％CI為(0.49,0.98)，提示攜帶CC基因型可能是鉛中毒的保護(hù)因素；rs17840761位

11、點(diǎn)CT基因型與TT基因型相比，OR=1.89，95％CI為(1.20,2.96)，校正混雜因素影響后，OR=1.83，95％CI為(1.13,2.93)，提示攜帶CT基因型可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 5.3按照作業(yè)環(huán)境鉛濃度分層后，不同的鉛暴露濃度組GRP78基因型與鉛中毒易感性的關(guān)聯(lián)不同，環(huán)境鉛暴露與基因型二者對(duì)鉛中毒的易感性可能存在一定的交互作用。環(huán)境鉛高濃度組，rs391957位點(diǎn)CT基因型可能是鉛中毒的保護(hù)因素。環(huán)境

12、鉛低濃度組，rs17840761位點(diǎn)CT基因型比TT基因型患鉛中毒的風(fēng)險(xiǎn)高。
　　 5.4 GRP78基因單倍型與鉛中毒易感性存在關(guān)聯(lián)，與單倍型CCG相比，TCG單倍型可能為鉛中毒的保護(hù)因素，OR值為0.36(0.20,0.64)，CTG單倍型可能為鉛中毒的危險(xiǎn)因素，OR值為1.55(1.12,2.14)。
　　 6.GRP78 SNP與血鉛、尿鉛、鉛中毒癥狀體征的關(guān)系
　　 6.1鉛中毒病例組的主要癥狀體征

13、r>　　 本研究的病例組共315例，臨床癥狀和體征以消化和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)為主。主訴無(wú)臨床癥狀者152例(48.2％)，腹痛、臍周隱痛者86例(27.2％)，頭暈、乏力者62例(19.8％)，四肢有麻木感者15例(4.8％)。體征以五官檢查發(fā)現(xiàn)鉛線，神經(jīng)系統(tǒng)檢查淺感覺(jué)消失、仲肌無(wú)力、橈神經(jīng)傳導(dǎo)異常為主，其中無(wú)特殊改變者283例(90.1％)，有鉛線者16例(5.1％)，神經(jīng)系統(tǒng)異常者15例(4.8％)。
　　 6.2 rs3919

14、57等位基因、基因型與血鉛、尿鉛、鉛中毒癥狀體征的關(guān)系
　　 在病例組，rs391957位點(diǎn)C等位基因的尿鉛濃度比T等位基因的尿鉛濃度低。CC基因型個(gè)體的尿鉛水平比TT基因型個(gè)體低。攜帶C等位基因和CC基因型的個(gè)體，存在腹痛、頭昏乏力、四肢麻木的比例明顯比對(duì)應(yīng)的T等位基因和TT基因型低，鉛中毒的癥狀和體征出現(xiàn)機(jī)率低，提示C等位基因和CC基因型可能是鉛中毒的保護(hù)因素。
　　 在對(duì)照組，rs391957位點(diǎn)C等位基因的血鉛濃

15、度比T等位基因的血鉛濃度低，攜帶CC基因型的個(gè)體尿鉛水平比TT基因型的個(gè)體低，提示C等位基因和CC基因型可能是鉛中毒的保護(hù)因素。
　　 6.3 rs17840761等位基因、基因型與血鉛、尿鉛、鉛中毒癥狀體征的關(guān)系
　　 在病例組，rs17840761位點(diǎn)C等位基因的血鉛濃度比T等位基因高，攜帶C等位基因和CT基因型個(gè)體的血ZPP水平比T等位基因和TT基因型的個(gè)體高。攜帶C等位基因和CT基因型的個(gè)體，存在腹痛、頭昏乏力、

16、四肢麻木的比例明顯比對(duì)應(yīng)的T等位基因和TT基因型高，鉛中毒的癥狀和體征出現(xiàn)的機(jī)率大，提示C等位基因和CT基因型可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 在對(duì)照組，rs17840761位點(diǎn)C等位基因的血鉛濃度高于T等位基因，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示C等位基因可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 6.4 GRP78單倍型與血鉛、尿鉛、鉛中毒癥狀體征的關(guān)系
　　 在病例組，攜帶CTG單倍型的個(gè)體血鉛、尿鉛濃度均比CCG單倍型高，腹痛的比

17、例也明顯高于CCG單倍型，鉛中毒的癥狀和體征較重，提示CTG單倍型可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 在對(duì)照組，攜帶TCG單倍型的個(gè)體血鉛、尿鉛濃度比CCG單倍型低，提示TCG單倍型可能是鉛中毒的保護(hù)因素。
　　 結(jié)論：
　　 1.GRP78基因SNP位點(diǎn)rs391957 C等位基因可能是鉛中毒保護(hù)因素，rs17840761位點(diǎn)C等位基因可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 2.GRP78基因SNP位點(diǎn)rs3919

18、57 CC基因型可能是鉛中毒的保護(hù)因素，rs17840761位點(diǎn)CT基因型可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 3.GRP78基因型與鉛中毒易感性的關(guān)系受環(huán)境鉛暴露強(qiáng)度影響，環(huán)境鉛高濃度組rs391957位點(diǎn)CT基因型可能是鉛中毒的保護(hù)因素，環(huán)境鉛低濃度組rs17840761位點(diǎn)CT基因型可能是鉛中毒的危險(xiǎn)因素。
　　 4.GRP78基因單倍型與鉛中毒易感性存在關(guān)聯(lián)。與單倍型CCG相比，TCG可能為鉛中毒的保護(hù)因素，CTG可能