融合抗原PstS1-LEP原核表達(dá)及血清學(xué)診斷.pdf

1、背景:結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起的結(jié)核病死灰復(fù)燃，常規(guī)結(jié)核病化療對耐藥、耐多藥結(jié)核病治療效果降低。雖然結(jié)核病預(yù)防有卡介苗(BCG)，治療有一線、二線抗結(jié)核化療藥物，然而全球結(jié)核病疫情仍十分嚴(yán)重，仍然是世界公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病控制包括診斷、治療、預(yù)防，隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，不斷發(fā)現(xiàn)用于結(jié)核病診斷和疫苗研制的M.tb抗原及其衍生抗原。
　　目的:本研究通過大腸桿菌表達(dá)M.tb融

2、合蛋白PstS1-LEP，并作為抗原，采用ELISA法檢測結(jié)核患者、肺外結(jié)核患者、肺部疾病患者以及健康人血清學(xué)抗PstS1-LEP IgG抗體，旨在評價(jià)新融合抗原用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的價(jià)值。
　　方法:(1)利用在線數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI分析20個(gè)蛋白的抗原表位，篩選得分高12條Th表位肽，每條15個(gè)氨基酸，首尾相連組成一條多肽LEP，根據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計(jì)編譯LEP的堿基序列，由上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成（N

3、端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)和C端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)）。目的基因經(jīng)DNA測序驗(yàn)證正確后與pET-28a-psts1載體相連，將重組質(zhì)粒pET-28a-psts1-LEP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。融合蛋白PstS1-LEP經(jīng)DEAE陰離子親和層析純化并稀釋透析復(fù)性。蛋白免疫印跡法(western blotting)檢測復(fù)性的PstS1-LEP蛋白與結(jié)核病患者來源血清和抗PstS1單抗反應(yīng);該蛋白作

4、為抗原，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺結(jié)核患者、肺外結(jié)核患者、肺部疾病患者和入伍新兵來源的血清IgG抗體，旨在評價(jià)該蛋白在血清學(xué)診斷方面的價(jià)值。
　　結(jié)果:人工合成了LEP蛋白編碼基因，該基因克隆到PET-28a-PstS1載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行全基因測序表明與LEP編碼堿基序列一致。重組PstS1-LEP蛋白在大腸桿菌中獲得表達(dá)，離子交換層析獲得較純目的蛋白，復(fù)性后蛋白濃度為1.25 mg/ml

5、。PstS1-LEP與結(jié)核病患者血清和抗PstS1單抗呈陽性反應(yīng)。肺結(jié)核患者血清中抗PstS1-LEP IgG抗體水平較高，顯著高于肺外結(jié)核病組、肺部疾病組和健康人組(P＜0.05)。208例肺結(jié)核患者和43例PPD-健康者血清IgG OD492nm采用ROC分析確定臨界值為0.43，PstS1-LEP用于血清學(xué)診斷的靈敏度和特異性、陽性預(yù)示值、陰性預(yù)示值分別為69.5％、68.4％、79.9％和55.3％;PstS1-LEP用于肺結(jié)核

6、患者血清學(xué)診斷敏感度顯著高于肺外結(jié)核(78.8％vs52.2％，x2=23.60，P=0.000)。208例肺結(jié)核患者和46例肺部疾病患者血清IgG OD492nm采用ROC分析確定臨界值為0.44，PstS1-LEP用于血清學(xué)診斷的靈敏度和特異性、陽性預(yù)示值、陰性預(yù)示值分別為67.9％、93.2％、94.8％和61.6％。采用不同對照進(jìn)行ROC曲線分析獲得不同的cutoff值，以肺部疾病組作對照，顯著提高了PstS1-LEP血清學(xué)診斷

7、特異度。研究發(fā)現(xiàn)接種BCG影響PstS1-LEP血清學(xué)診斷，因?yàn)榭ê劢M抗PstS1-LEP IgG抗體水平顯著高于無卡痕組(P=0.008);健康者皮試反應(yīng)大小也影響PstS1-LEP血清學(xué)診斷，因?yàn)镻PD皮試陽性健康組抗PstS1-LEP IgG抗體水平顯著高于PPD皮試陰性健康組(P＜0.05)。因此，BCG接種和Mtb感染均可能影響PstS1-LEP血清學(xué)用于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷;因此，該抗原雖然有一定診斷價(jià)值，但其診斷敏感度和特異