MicroRNA-486在造血細(xì)胞紅系分化中的表達(dá)及機(jī)制研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA主要在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮對(duì)基因的調(diào)控作用,包括造血干細(xì)胞的自我更新和分化過程,但其在造血細(xì)胞分化的表達(dá)及其對(duì)分化的調(diào)控作用并不清楚。
　　MicroRNA-486(miR-486)首先在人胎肝組織中被鑒定,因?yàn)槿颂ジ谓M織是造血增殖分化最旺盛的組織之一,利用經(jīng)典方法從胎肝組織中鑒定的miRNA無疑是高豐度并可能參與造血生成過程調(diào)節(jié)

2、的重要miRNA。miR-486基因組學(xué)分析表明該基因(GeneID:619554)位于8號(hào)染色體Ankyrin-1(Ank-1)基因的第40個(gè)內(nèi)含子(8p11.21位點(diǎn))。Ank-1在肌肉組織、紅細(xì)胞及腦組織等組織中廣泛存在,但與造血干細(xì)胞調(diào)控的關(guān)系仍然不清楚。本論文將對(duì)miR-486在造血干細(xì)胞分化中的表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行闡述。
　　本課題首先利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)方法檢測了小鼠各臟器及血液中miR-

3、486的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-486在血液、肌肉和心肌中高表達(dá),并且其在造血細(xì)胞中表達(dá)量最高。我們課題組前期研究工作基礎(chǔ):在比較慢性粒細(xì)胞白血病(CML)和正常CD34+細(xì)胞MicroRNA表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-486在CMLCD34+細(xì)胞高表達(dá),進(jìn)一步證明miR-486與CMLBCR-ABL融合基因的促紅系分化相關(guān)。第二,分離人臍帶血CD34+細(xì)胞,并在含有不同造血生長因子組合的培養(yǎng)體系中進(jìn)行分化誘導(dǎo)并利用流式細(xì)胞儀檢測造血細(xì)胞分化

4、效率,同步利用RT-QPCR方法檢測miR-486的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著造血干細(xì)胞向紅系分化,miR-486表達(dá)水平隨之增高;第三,文獻(xiàn)調(diào)研顯示:GATA1是第一個(gè)被識(shí)別也是最重要的GATA家族因子,在紅系細(xì)胞中大量表達(dá),同時(shí)也是在紅系分化和成熟過程中起關(guān)鍵作用的中心轉(zhuǎn)錄因子,許多具有紅系特異功能的基因均受GATA1的調(diào)控。我們通過慢病毒介導(dǎo)的GATA1沉默策略,沉默臍帶血CD34+細(xì)胞GATA1的表達(dá),并同步檢測miR-486的表達(dá)水平

5、。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GATA1的沉默效率可以達(dá)到82％,可以有效阻斷CD34+細(xì)胞向紅系分化,同時(shí)miR-486的表達(dá)水平也明顯降低?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn),第10天時(shí)計(jì)數(shù)紅系集落,對(duì)照組紅系集落數(shù)為54±4.89,GATA1沉默組紅系集落數(shù)為16±5,P<0.05,結(jié)果表明GATA1沉默抑制臍帶血CD34+細(xì)胞的紅系分化,與分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。以上結(jié)果均證明了miR-486在造血干細(xì)胞紅系分化過程中起到重要的作用。
　　MicroRNA通過3’UTR

6、調(diào)控靶基因表達(dá)并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。單一MicroRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá),而單一靶基因也可受到多個(gè)MicroRNA的調(diào)控。通過靶基因的分析可以預(yù)測MicroRNA的生物學(xué)功能。我們利用Targetscan6.2檢索發(fā)現(xiàn)miR-486存在多個(gè)預(yù)測靶基因,其中FOXO1,PTEN,ARID4B等與白血病發(fā)病密切相關(guān)。為此我們克隆了ARID4B基因的3′UTR并構(gòu)建了PGL-3M熒光素酶報(bào)告載體,將報(bào)告載體和miR-486表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染