Eos蛋白在紅系和巨核系分化中的功能研究.pdf

1、背景：
　　造血分化是生物體內重要的生理過程，不僅涉及造血干細胞(Hematopoietic stemcells，HSC)的自我更新、各鏈系祖細胞的定向分化，還包括祖細胞向成熟血細胞分化和發(fā)育的全過程。紅系分化和巨核系分化是造血分化的重要分支，也是貫穿人一生的重要生理過程。轉錄因子Eos也叫IKZF4(ikaros familyzinc finger4)，是鋅指蛋白轉錄因子ikaros家族中的一員。作為負性調節(jié)因子可以參與許多基因

2、的表達調控。有研究表明，Eos也參與了造血過程中紅系的分化，但作用機制還不清楚。而關于Eos在巨核系分化中的作用及其機制知之更少。
　　目的：
　　分析轉錄因子Eos在紅系和巨核系分化中的作用，并初步探討其調控機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng):將生長狀態(tài)良好的K562細胞分為紅系誘導組和巨核系誘導組進行傳代培養(yǎng)。前者傳至4個中號培養(yǎng)皿中，分別標記為0h、12h、24h、48h4個時間段，加入50μM氯化高鐵血

3、紅素(Hemin)。后者傳至6個中號培養(yǎng)皿中，分別標記為0h、12h、24h、48h、72h、96h，6個時間段，加入50pM佛波酯(PMA)。在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導K562細胞分別向紅系和巨核系分化。
　　2.聯(lián)苯胺染色與瑞氏-姬姆薩染色:收集各組細胞，1000 rpm離心5min，收集沉淀，用胎牛血清重懸，涂片染色，鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。
　　3.流式細胞檢測:收集各培養(yǎng)組細胞，檢測誘導前后細胞分化相

4、關表面標志物CD41a、CD61、CD235a、CD71的表達情況。
　　4.Real-time PCR檢測:收集細胞，提取RNA，檢測誘導后Eos mRNA的表達量。
　　5.Western blot蛋白檢測:收集各培養(yǎng)組細胞，裂解后提取蛋白，Western blot檢測誘導前后轉錄因子Eos和紅系特異轉錄因子GATA-1蛋白的表達情況。
　　結果：
　　1.K562細胞經PMA誘導后瑞氏-姬姆薩染色，隨著誘導

5、時間的延長細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞體積變大，核越來越大，大核細胞增多，這些結果進一步顯示PMA誘導K562細胞巨核系分化成功。
　　2.K562細胞經Hemin誘導后，隨紅系分化過程Eos蛋白和mRNA表達水平逐漸下降。
　　3.K562細胞中過表達Eos，然后經Hemin誘導48h后，流式結果顯示紅系細胞表面標志CD71、CD235a的表達量明顯低于對照組，說明Eos對K562細胞紅系分化有抑制作用。
　　4.過表

6、達Eos的K562細胞經Hemin誘導48h后，聯(lián)苯胺染色顯示細胞紅系分化的陽性率明顯低于對照組，進一步說明Eos蛋白對紅系分化有抑制作用。
　　5.K562細胞經PMA誘導后Eos蛋白表達水平逐漸下降，GATA-1蛋白水平逐漸升高。
　　6.K562細胞經PMA誘導后，巨核系細胞表面標志CD41a、CD61表達量隨誘導時間延長而升高，說明PMA對K562細胞的巨核系分化誘導成功。
　　結論：
　　Eos蛋白在H