水通道蛋白4在人創(chuàng)傷性腦水腫早期表達(dá)的研究.pdf

1、目的： 急性顱腦損傷后會(huì)發(fā)生不同程度的腦水腫，且水腫的程度和持續(xù)時(shí)間與繼發(fā)性顱腦損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最近有實(shí)驗(yàn)直接驗(yàn)證了水通道蛋白4(aquaporins-4，AQP4)參與了腦水腫的形成。Manley等在急性水中毒腦水腫模型中研究顯示，AQP4在水腫模型的腦組織內(nèi)高表達(dá)，而正常鼠腦AQP4低表達(dá)；研究者在缺血性腦水腫模型中，與正常組相比，應(yīng)用基因敲除技術(shù)使AQP4在腦組織表達(dá)缺乏，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺乏AQP4的大鼠生存能力強(qiáng)，持

2、續(xù)大腦中動(dòng)脈阻塞缺血后24h測(cè)定大腦半球腫脹百分率下降35％，臨床結(jié)局明顯改善，說明了AQP4參與腦水腫的形成，并在腦水腫中起重要作用。 水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是90年代初發(fā)現(xiàn)的存在于動(dòng)植物細(xì)胞膜上具有高度選擇性水孔道特異蛋白質(zhì)家族，在水代謝的調(diào)節(jié)中起著重要作用。1994年利用水通道蛋白家族的同源性克隆技術(shù)分離出一種腦內(nèi)水通道蛋白-AQP4。其基本結(jié)構(gòu)同其他水通道蛋白一樣，為分子量約30 kD的疏水性蛋白，

3、每個(gè)單體包括6個(gè)跨膜傾斜的a-螺旋結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)的氨基和羧基端。這6個(gè)跨膜區(qū)由5個(gè)環(huán)連接(A-E)組成。B環(huán)及E環(huán)有高度保守的天冬酸氨-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)結(jié)構(gòu)域。研究表明，6個(gè)跨膜區(qū)包繞著B環(huán)及E環(huán)形成一個(gè)筒狀結(jié)構(gòu)作為水分子通道。免疫組化發(fā)現(xiàn)，①AQP4蛋白在腦中的含量最高，分布于腦表面的軟腦膜、導(dǎo)水管和腦室系統(tǒng)的室管膜、脈絡(luò)叢，與腦脊液重吸收部位一致，腦脊液可通過其它細(xì)胞的AQP4重吸收；②星形膠質(zhì)細(xì)胞，特

4、別是靠近蛛網(wǎng)膜下腔、位于血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞表面上和星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足緊密包繞毛細(xì)血管壁形成的一層膠質(zhì)界膜上也表達(dá)強(qiáng)烈，由于此界膜構(gòu)成血腦屏障的第二道隔膜，起調(diào)節(jié)水運(yùn)輸?shù)淖饔?；③下丘腦視上核、室旁核和下丘腦的渴中樞，視上核和室旁核核團(tuán)的神經(jīng)大分泌細(xì)胞的牽張敏感性離子通道對(duì)細(xì)胞膨脹等容量變化十分敏感，滲透壓改變1％即可發(fā)生反應(yīng)，通過合成和釋放抗利尿激素(AVP)調(diào)節(jié)腎臟水的排泄，推測(cè)AQP4可能是滲透壓感受器或受體，通過加強(qiáng)對(duì)微小滲透壓

5、變化產(chǎn)生迅速而敏感的細(xì)胞容量改變，而在下丘腦調(diào)節(jié)滲透壓；④海馬的錐體細(xì)胞層、齒狀回的顆粒細(xì)胞層和多形細(xì)胞層，分布在海馬的AQP4目前其功能不明確。AQP4分布特點(diǎn)是膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管之間水調(diào)節(jié)和運(yùn)輸?shù)闹匾Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，與腦脊液重吸收、滲透壓調(diào)節(jié)、腦水腫形成等生理、病理過程密切相關(guān)。但目前人們對(duì)顱腦損傷后腦水腫發(fā)生的具體病理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚，關(guān)于AQP4在外傷性腦水腫中的作用，由于研究方法、手段以及觀察時(shí)間的不同，結(jié)論并不一致，且大部

6、分實(shí)驗(yàn)仍以動(dòng)物為研究對(duì)象，病理狀態(tài)下人體的研究很少。有些研究認(rèn)為AQP4及其上調(diào)導(dǎo)致了外傷性腦水腫的形成。Sun發(fā)現(xiàn)自由落體致大鼠腦損傷24小時(shí)后，損傷區(qū)腦水腫程度最顯著，AQP4的表達(dá)在損傷區(qū)腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞上明顯上調(diào)，在周邊臨近區(qū)下調(diào)，在遠(yuǎn)處無明顯變化，因此認(rèn)為AQP4的上調(diào)可能是引起損傷區(qū)腦水腫的主要途徑和原因。然而，還有一些學(xué)者研究認(rèn)為發(fā)生腦水腫時(shí)，AQP4表達(dá)增加或減少是星形膠質(zhì)細(xì)胞適應(yīng)細(xì)胞外環(huán)境變化而做出的反應(yīng)，是一種內(nèi)源

7、保護(hù)機(jī)制。Kiening等人觀測(cè)到大鼠壓縮氣擊致腦損傷模型中傷后24小時(shí)水腫最嚴(yán)重，而AQP4 mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，在損傷半球降低更為顯著，因?yàn)榇穗A段以細(xì)胞性水腫為主，AQP4 mRNA下調(diào)可能減少了水在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的進(jìn)一步積聚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用透射電鏡對(duì)人體急性顱腦損傷后水腫腦組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，通過免疫組化的方法研究AQP4在人腦組織中的表達(dá)情況，更直接理解AQP4、血腦屏障在腦水腫發(fā)生中所產(chǎn)生的作用，為開發(fā)腦水腫形成阻斷劑

8、及尋找腦水腫靶向治療提供理論依據(jù)，這對(duì)于急性顱腦損傷后腦水腫的防治，降低死亡率、致殘率具有重要的臨床價(jià)值。 材料與方法： 1．實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源28例創(chuàng)傷組腦組織標(biāo)本取自廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院2006年3月至2006年9月急性顱腦損傷患者急診行開顱清除血腫時(shí)所獲挫傷周圍腦組織，距發(fā)病時(shí)間2～24h。男性18例，女性10例，年齡15～60歲，平均年齡35.3歲，GSC評(píng)分3-10分，頭顱CT提示為額葉、顳葉局部腦挫傷出血，中線結(jié)構(gòu)移

9、位明顯。因正常腦組織難以取材，故取8例原發(fā)性癲癇病人病灶切除所獲取的相對(duì)正常腦組織為正常對(duì)照，男性5例，女性3例，平均年齡23歲。 2．應(yīng)用常規(guī)HE染色、透射電鏡對(duì)28例急性顱腦損傷患者挫傷周圍腦組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察；應(yīng)用免疫組化方法對(duì)水通道蛋白4(AQP4)在人腦組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究。 3．應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，取每張免疫組化染色切片上平均灰度值代表AQP4蛋白含量?；叶戎蹈撸砻髟撐镔|(zhì)含量

10、低，灰度值愈低，則表明該物質(zhì)含量高。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件兩獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.01表示有顯著性差異。 結(jié)果： 1．挫傷周圍腦組織HE染色：光學(xué)顯微鏡下見腦組織疏松，細(xì)胞和血管周圍空隙變大，血管厚薄不均，部分中斷缺損，組織間廣泛出血。 2．透射電鏡觀察：挫傷周圍腦組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，血管內(nèi)細(xì)胞的線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)不清，血管腔狹窄，血腦屏障破壞明顯，血管周圍

11、見“空泡樣”變。腦組織細(xì)胞腫脹明顯，胞漿呈空泡樣改變，核周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)大，線粒體腫脹，胞核固縮，核中染色質(zhì)部分溶解，電子密度增高。 3．免疫組織化學(xué)結(jié)果表明：正常對(duì)照組腦組織中AQP4可見少量表達(dá)，急性顱腦損傷后不久，AQP4表達(dá)即明顯升高。(P<0.001)，主要表達(dá)在小血管及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。 結(jié)論： 1．急性顱腦損傷患者挫傷周圍腦組織血腦屏障受損是腦水腫發(fā)生的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。 2．實(shí)驗(yàn)研究表明AQP4蛋白主要