柚皮素對RSV感染引起氣道黏液高分泌的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:觀察黏蛋白MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白分泌、活性氧(Reactive OxygenSpecies，ROS)、JNK/AP-1通路相關(guān)蛋白在呼吸道合胞病毒(Respiratory SyncytialVirus，RSV)感染人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)氣道黏液高分泌模型中及柚皮素干預(yù)后表達(dá)水平的變化，探討柚皮素(Naringenin，Nar)對RSV感染引起氣道黏液高分泌的作用及可能涉及的機(jī)制。
　　方法:
　　(1)將傳代

2、培養(yǎng)的A549細(xì)胞隨機(jī)分成:C組（正常細(xì)胞對照組），R1組（感染復(fù)數(shù)MOI=0.5）、R2組(MOI=1.0)、R3組(MOI=5.0)。以不同的病毒滴度感染細(xì)胞2h，加細(xì)胞維持液培養(yǎng)制作RSV感染細(xì)胞模型;各組干預(yù)24 h后，采用實時熒光定量PCR及ELISA技術(shù)檢測MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平，并測定各組細(xì)胞ROS相對含量。(2)通過細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)選取合適的Nar給藥濃度，將傳代培養(yǎng)后的A549細(xì)胞隨機(jī)分成7組

3、:C組，R2組，N1組(Nar30μmol/L+RSV)、N2組(Nar100μmol/L+RSV), N3組(Nar30μmol/L組)、N4組(Nar100μmol/L組)，S組(SP600125+RSV)，D組（二甲基亞砜DMSO組）。N1、N2組以Nar預(yù)處理1h后加用RSV感染2h，感染后加入新鮮Nar培養(yǎng)基至實驗終止。N3、N4組加入指定濃度Nar培養(yǎng)基培養(yǎng)至實驗終止。S組用SP600125預(yù)處理1h后加用RSV感染2h，感

4、染后加入細(xì)胞維持液培養(yǎng)至實驗終止。D組以0.01％DMSO處理24h。各組在干預(yù)24 h收集培養(yǎng)板中細(xì)胞或者上清液，采用實時熒光定量PCR及ELISA法檢測MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平;Western blot檢測JNK、p-JNK及AP-1蛋白的表達(dá)水平;測定細(xì)胞ROS的相對含量;進(jìn)一步采用細(xì)胞免疫熒光法直接觀察黏蛋白MUC5AC的分布及表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　(1) RSV病毒滴度:通過Reed-Muenc

5、h公式計算RSV滴度為107.0TCID50/ml，即7×106 p.f.u/ml。
　　(2)不同濃度RSV感染后MUC5AC mRNA及蛋白、ROS水平的變化:C組MUC5AC mRNA及蛋白、ROS水平依次為:1.00±0.00、34.38±0.95μg/L、125.3±1.20; R1組依次為1.45±0.10、38.61±0.41μg/L、152.3±0.33; R2組依次為2.67±0.09、44.11±0.96μg/

6、L、170.3±0.88; R3組依次為4.82±0.275、1.01±0.48μg/L、234.3±1.33;與C組相比，RSV感染后MUC5AC mRNA及蛋白、ROS水平均增高(P＜0.05)，與感染濃度成濃度依賴性。
　　(3) CCK-8法測定Nar對A549細(xì)胞的增殖毒性，選取合適的干預(yù)濃度:30、50、80、100、200、400、800μmol/L Nar處理A549細(xì)胞后吸光度A值依次為1.57±0.07、1.5

7、4±0.09、1.52±0.06、1.47±0.07、1.25±0.05、1.12±0.13、1.03±0.14，與細(xì)胞對照組吸光度1.58±0.06相比，30-100μmol/L組無顯著性差異（P＞0.05），表明30-100μmol/L Nar干預(yù)細(xì)胞24h后對細(xì)胞增殖活性無影響。因此，選擇干預(yù)濃度為低濃度30μmol/L和高濃度100μmol/L。
　　(4) Nar干預(yù)對MUC5AC mRNA和蛋白水平的影響:C組、R2組

8、、N1組、N2組、N3組、N4組及D組的MUC5AC mRNA水平依次為1.00±0.00、2.52±0.10、2.31±0.06、1.90±0.01、0.99±0.04、0.85±0.03、1.20±0.03; MUC5AC蛋白水平依次為37.62±1.18μg/L、46.72±0.87μg/L、43.60±0.45μg/L、40.55±0.45μg/L、38.73±0.55μg/L、37.08±1.35μg/L、37.12±0.91

9、μg/L。與C組相比，R2組MUC5ACmRNA和蛋白水平顯著增加(P＜0.05);N1、N2組與R2組相比，MUC5AC mRNA和蛋白水平顯著降低，隨Nar濃度增加，抑制效果更明顯，呈劑量相關(guān)性(P＜0.05);N3、N4組與C組相比，MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);D組與C組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果也顯示RSV感染后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)增加，而Na

10、r可抑制其表達(dá)。
　　(5) Nar干預(yù)對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響:C組、R2組、N1組、N2組、N3組、N4組及D組的ROS水平依次為121.1±0.69、174.7±1.78、170.8±1.39、152.4±1.97、122.0±2.75、120.3±1.67、124.6±0.84。與C組相比，R2組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高(P＜0.05);D組與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。N1、N2組與R2組相比，ROS水平顯著降

11、低，隨Nar濃度增加，抑制效果更明顯，呈劑量相關(guān)性（P＜0.05）。
　　(6) ROS與MUC5AC mRNA及蛋白的相關(guān)性分析:細(xì)胞內(nèi)ROS含量與MUC5AC mRNA及上清液蛋白含量呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為:r=0.9520，r=0.7682, P＜0.01, n=40)。
　　(7) Nar對細(xì)胞內(nèi)JNK、 p-JNK及AP-1蛋白的影響:C組、R2組、N2組、S組、D組JNK蛋白相對表達(dá)量依次為1.00±0.0

12、0、1.02±0.03、1.01±0.03、1.01±0.04、1.01±0.02;各組p-JNK相對表達(dá)量為1.00±0.00、3.31±0.34、2.10±0.27、1.97±0.16、1.18±0.38;AP-1相對表達(dá)量依次為1.00±0.00、1.94±0.05、1.40±0.03、1.36±0.05、1.02±0.02。各組JNK蛋白水平無明顯差異(P＞0.05)。與C組相比，R2組p-JNK、AP-1蛋白表達(dá)增加，差異具有

13、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與R2組相比，N2組、S組p-JNK、AP-1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 N2組與S組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　(8) Nar和SP600125對細(xì)胞上清液中MUC5AC蛋白的影響:C組、R2組、N2組、S組、D組細(xì)胞上清液中MUC5AC蛋白表達(dá)量依次為36.67±1.50μg/L、48.19±0.47μg/L、43.17±1.06μg/L、44.02±0.99

14、μg/L、38.82±1.18μg/L。與C組相比，R2組MUC5AC蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與R2組相比，N2組、S組MUC5AC蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。N2組與S組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1) RSV感染A549細(xì)胞后可引起ROS、MUC5AC基因及蛋白表達(dá)水平增加，兩者成顯著正相關(guān)。
　　(2) RSV感染A549細(xì)胞后存在JN