補(bǔ)脾益氣方藥對(duì)脾虛哮喘大鼠模型氣道黏液高分泌的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本課題采用形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，觀察了補(bǔ)脾益氣方藥治療前、后的脾虛哮喘大鼠模型氣道黏液高分泌、AQP5表達(dá)等變化，旨在探討補(bǔ)脾益氣方藥對(duì)脾虛哮喘氣道黏液高分泌的影響及機(jī)制，為闡明補(bǔ)脾益氣方藥治療脾虛型哮喘的藥理學(xué)機(jī)制、以及為中醫(yī)“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”的理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 50只Wistar雄性大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字法分為5組：生理鹽水對(duì)照組(對(duì)照組)，脾虛哮喘模型組(脾虛哮喘

2、組)，哮喘模型組(哮喘組)，脾虛哮喘中藥治療組(脾虛哮喘治療組)，哮喘中藥治療組(哮喘治療組)。脾虛哮喘組和脾虛哮喘治療組首先采用飲食不節(jié)、疲勞過(guò)度和苦寒泄下等復(fù)合因素作用建立脾虛模型，共10d。然后，與哮喘模型組和哮喘治療組一起采用卵蛋白致敏和激發(fā)的方法建立哮喘模型。在實(shí)驗(yàn)第11d脾虛模型建立成功后，脾虛哮喘治療組和哮喘治療組給予補(bǔ)脾益氣方藥進(jìn)行灌胃治療，共21d。
　　 1.實(shí)驗(yàn)第32d進(jìn)行外周血和支氣管肺泡灌洗液(BALF

3、)中嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)百分比測(cè)定；采用蘇木素.伊紅(HE)染色法進(jìn)行肺組織病理形態(tài)學(xué)測(cè)定；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行血清總免疫球蛋白E(IgE)含量、血清和BALF中白介素—4(IL—4)、干擾素—γ(IFN—γ)含量及BALF中黏蛋白5AC(MUC5AC)含量測(cè)定：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT—PCR)進(jìn)行肺組織MUC5AC的mRNA表達(dá)水平測(cè)定；采用免疫組化法進(jìn)行肺組織MUC5AC蛋白表達(dá)水平測(cè)定；
　　 2

4、.實(shí)驗(yàn)第32d進(jìn)行肺組織濕/干質(zhì)量比測(cè)定；采用RT—PCR.進(jìn)行肺組織AQP5的mRNA表達(dá)水平測(cè)定；采用免疫組化法和免疫印跡法進(jìn)行肺組織AQP5蛋白表達(dá)水平的測(cè)定：
　　 3.采用ELISA進(jìn)行血清和BALF中TNF—α含量測(cè)定；采用免疫組化法進(jìn)行肺組織IkBα蛋白表達(dá)水平和NF—kBp65入核率測(cè)定。
　　 結(jié)果：
　　 1.外周血和BALF中EOS百分比檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組與哮喘組均顯著升

5、高(P<0.01)，而脾虛哮喘組明顯高于哮喘組(P<0.01)；但脾虛哮喘治療組則低于脾虛哮喘組(P<0.01)，哮喘治療組低于哮喘組(P<0.01)。
　　 2.血清和BALF中IL—4和IFN—γ含量、及血清總IgE含量檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組和哮喘組血清和BALF中IL—4與血清總IgE含量均顯著升高(P<0.01)，而IFN—γ，含量與IFN—γ/IL—4比值均顯著降低(P<0.01)；但脾虛哮喘組上述變化

6、較哮喘組更加明顯(P<0.01)。與脾虛哮喘組或哮喘組比較，脾虛哮喘治療組或哮喘治療組血清和BALF中IL—4和血清總IgE含量均降低(P<0.01)，而IFN—γ含量與IFN—γ/IL—4比值均升高(P<0.01)。
　　 3.光學(xué)顯微鏡觀察，可見脾虛哮喘組和哮喘組大鼠的支氣管管壁和伴行動(dòng)脈周圍有較多的Eos、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并且支氣管黏膜皺壁增多、延長(zhǎng)，氣管管腔縮小，杯狀細(xì)胞增生，基底膜增厚，氣道腔內(nèi)可見炎性分泌物，

7、有的小支氣管被黏液栓和炎性細(xì)胞所閉塞。脾虛哮喘治療組和哮喘治療組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生等癥狀得到改善。
　　 4.大鼠BALF中MUC5AC含量和基因表達(dá)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組和哮喘組均顯著升高(P<0.01)。其中脾虛哮喘組表達(dá)水平高于哮喘組(P<0.01)，經(jīng)治療后，兩治療組基因表達(dá)水平均低于治療前水平(P<0.01)。
　　 5.肺組織濕/干質(zhì)量比值結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組和哮喘組均顯著升

8、高(P<0.01)，且脾虛哮喘組高于哮喘組(P<0.01)。但是，脾虛哮喘治療組則低于脾虛哮喘組(P<0.01)；哮喘治療組則低于哮喘組(P<0.01)。
　　 6.肺組織AQP5的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組和哮喘組均顯著降低(P<0.01)，并且脾虛哮喘組低于哮喘組(P<0.01)；經(jīng)治療，兩治療組其表達(dá)分別高于治療前水平(P<0.01)。
　　 7.血清和BALF中TNF—α含量測(cè)定結(jié)果表明

9、：與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組和哮喘組均顯著升高(P<0.01)，但是脾虛哮喘組和哮喘組組間比較則無(wú)差異性(P>0.05)。不過(guò)脾虛哮喘治療組顯著低于脾虛哮喘組(P<0.01)，哮喘治療組低于哮喘組(P<0.01)。
　　 8.肺組織IkBα和NF—kBp65的免疫組化結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，脾虛哮喘組和哮喘組大鼠肺組織IkBα的蛋白表達(dá)水平均降低，而NF—kBp65入核率增加(P<0.01)，此變化在脾虛哮喘組表現(xiàn)的更為明顯(P<

10、0.01)。但是，經(jīng)過(guò)治療后，兩治療組上述變化分別高于、低于治療前(P<0.01)。
　　 9.相關(guān)性分析結(jié)果：肺組織AQP5的表達(dá)水平和BALF中MUC5AC的含量和MUC5AC表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。血清和BALF中TNF—α的含量和肺組織IkBα表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，和肺組織NF—kBp65入核率呈正相關(guān)：肺組織NF—kB活性和肺組織AQP5的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。肺組織NF—kB活性和BALF中MUC5AC含量和肺組織MUC5AC的表

11、達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.脾虛使哮喘大鼠模型外周血和BALF中EOS百分比、血清IL—4及血清總IgE含量進(jìn)一步增加，IFN—γ含量進(jìn)一步下降。補(bǔ)脾益氣方藥能夠?qū)⑵淠孓D(zhuǎn)。
　　 2.脾虛使哮喘模型大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值、BALF中MUC5AC含量、肺組織MUC5AC表達(dá)進(jìn)一步升高；肺組織AQP5的表達(dá)水平進(jìn)一步降低。補(bǔ)脾益氣方藥均能夠使其不同程度逆轉(zhuǎn)。
　　 3.補(bǔ)脾益氣方藥能夠降低脾虛