TLR4在大鼠腦梗死組織中的動態(tài)表達及OMT抗炎機制的研究.pdf

1、目的：腦梗死后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制復雜，其中過度炎癥免疫反應存在于腦梗死后壞死及缺血區(qū)域，導致炎癥損傷，此己成共識，因此減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。然而，在臨床試驗中抗炎治療并沒有取得預期的效果，或許這些藥物抑制炎癥通路的效果有限。Toll樣受體(Toll-1ike receptors,TLRs)的發(fā)現(xiàn)促進了人們對炎癥機制的理解，其中TLR4的結(jié)構及其參與促炎反應、促進免疫細胞成熟分化及調(diào)節(jié)免疫應答等方面研究的較

2、為清楚。近年來，TLR4在非病原微生物性炎癥損傷中的作用逐漸引起了人們的關注，發(fā)現(xiàn)其在腦梗死等非病原微生物性炎癥損傷過程中具有重要的作用。 氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)是從豆科槐屬植物苦參(Sophora flavescens Ait)中提取的生物堿，具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用，近幾年對于OMT的研究很多，多集中在抗肝炎及抗腫瘤等方面，但關于氧化苦參堿對腦血管

3、疾病的研究鮮有報道。本實驗應用RT-PCR技術觀察了不同劑量OMT對腦梗死大鼠腦組織TLR4 mRNA相對表達的影響，應用免疫組織化學方法觀察OMT對腦梗死大鼠腦組織TLR4蛋白表達的影響，旨在從TLR4基因、蛋白水平探討OMT抗炎作用機制。 方法：80只健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，隨機分成4組：假手術組，生理鹽水治療組，大劑量OMT治療組(120 mg/kg)，小劑量OMT治療組(80 mg/kg)，每組根據(jù)不同

4、的時間點又分為6 h、12 h、24 h、48 h四個亞組，每亞組均為5只大鼠。按照改良的線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞模型。將OMT以蒸餾水制成相同濃度混懸液(40 mg/ml)，大劑量OMT治療組給予OMT 120 mg/kg，小劑量OMT治療組給予OMT 80 mg/kg，生理鹽水治療組均給予1 ml生理鹽水，各組均為腹腔注射給藥，手術完畢后即刻給藥一次，之后每天一次，直至相應時間點斷頭處死動物。假手術組，除不插線栓外其余操作同生理

5、鹽水治療組。各實驗組于相應時間點斷頭處死動物，無菌操作下取前囟前2 mm至前囟后3 mm腦組織，以前囟后0.5 mm為界分為前后兩部分，前部分取梗死灶周圍腦組織，快速稱取100 mg，置凍存管中放入液氮保存待用，用于抽提總RaNA，RT-PCR技術觀察不同劑量OMT對腦梗死大鼠腦組織TLR4 mRNA相對表達的影響。后部分腦組織用4％多聚甲醛固定液固定24 h以上，但不能超過7 d，石蠟包埋，冠狀切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(Hemotoxy

6、lin-esion,HE)染色觀察大鼠腦組織的病理改變，應用免疫組化法檢測不同劑量OMT對腦梗死大鼠腦組織TlR4動態(tài)表達的影響。 結(jié)果： 1.腦組織切片HE染色觀察：假手術組無梗死灶，神經(jīng)元結(jié)構、形態(tài)正常，無間質(zhì)水腫。生理鹽水治療組、OMT小劑量治療組可見缺血中心區(qū)組織疏松，形似海綿；神經(jīng)元胞體縮小，變形、核固縮；間質(zhì)水腫明顯；隨時間延長多形核白細胞(Polymorphonuclear leukocyte，PMN)浸潤

7、增多，其中PMN浸潤在48 h最明顯，OMT大劑量治療組與生理鹽水治療組比較PMN浸潤明顯減輕。 2 各實驗組腦組織TLR4 mRNA相對表達：各實驗組各時間點TLR4 mRNA/β-actin mRNA灰度比值表明：各實驗組各時間點TLR4 mRNA均有表達。假手術組與生理鹽水治療組、OMT小劑量治療組及OMT大劑量治療組比較，假手術6 h組為0.48±0.27，生理鹽水6 h組為0.73±0.07，OMT小劑量6 h組為0.65±0

8、.02，OMT大劑量6 h組為0.51±0.04，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水6 h組與OMT小劑量6h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義，假手術6 h組與OMT大劑量6 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；假手術12 h組為0.50±0.01，生理鹽水12 h組為0.91±0.07，OMT小劑量12 h組為0.81±0.09，OMT大劑量12 h組為0.68±0.10，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水12 h組與

9、OMT小劑量12 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；假手術24 h組為0.50±0.00，生理鹽水24 h組為1.09±0.10，OMT小劑量24 h組為0.99±0.11，OMT大劑量24 h組為0.77±0.01，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水24 h組與OMT小劑量24 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；假手術48 h組為0.49±0.03，生理鹽水48 h組為1.14±0.18，OMT小劑量48 h組為1.01

10、±0.04，OMT大劑量48 h組為0.82±0.05，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水48 h組與OMT小劑量48 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義。 3.各實驗組腦組織TLR4的動態(tài)表達：假手術組各時間點僅有少量TLR4表達；TLR4表達以小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)兀細胞為主，位于細胞胞漿內(nèi)，室管膜和腦室脈絡叢上皮細胞有弱陽性表達。假手術組與生理鹽水治療組、OMT小劑量治療組、OMT大劑量治療組比較，(以下數(shù)值單位均為“個

11、”)假手術6 h組為0.48±0.18，生理鹽水6 h組為1.64±0.24，OMT小劑量6 h組為1.14±0.21，OMT大劑量6 h組為0.63±0.07，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水6 h組與OMT小劑量6 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義，假手術6 h組與OMT大劑量6 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；假手術12 h組為0.38±0.18，生理鹽水12 h組為6.10±0.29，OMT小劑量12 h組為5

12、.21±0.49，OMT大劑量12 h組為3.36±0.55，p＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水12 h組與OMT小劑量12 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義；假手術24h組為0.44±0.17，生理鹽水24 h組為10.42±0.79，OMT小劑量24 h組為8.91±0.32，OMT大劑量24 h組為6.33±0.63，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水24 h組與OMT小劑量24 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意

13、義；假手術48 h組為0.40±0.25，生理鹽水48 h組為10.67±0.99，OMT小劑量48 h組為9.32±0.70，OMT大劑量48 h組為6.54±0.89，P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，其中生理鹽水48 h組與OMT小劑量48 h組比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義。結(jié)論：局灶性腦梗死后損傷組織釋放的內(nèi)源性激活物被TLR4識別，啟動了TLR4的信號傳導通路，進一步激活并釋放致炎細胞因子而造成組織損傷。而氧化苦參堿可以降低TL