HMGB1、RAGE及TLR4在腦梗死大鼠腦組織的動(dòng)態(tài)表達(dá)及丹參酮ⅡA的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、目的：缺血性腦血管病是常見(jiàn)病、多發(fā)病，病死率和致殘率均高。腦缺血后損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激，Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)等，其中過(guò)度炎癥免疫反應(yīng)存在于腦梗死后壞死及缺血區(qū)域，導(dǎo)致炎癥損傷，已達(dá)成共識(shí)，因此，減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。然而，抗炎治療在腦梗死的臨床研究中并沒(méi)有取得預(yù)期效果。尋找炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游的始動(dòng)因素并加以抑制可能為腦梗死的治療帶來(lái)新的突破。高遷移率族蛋白B1( high

2、 mobility groupbox l，HMGB1)誘導(dǎo)的核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路激活在缺血性腦血管病引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡中起著重要的作用，采用藥物抑制腦缺血導(dǎo)致的HMGB1信號(hào)通路激活是缺血性腦中風(fēng)臨床藥物治療的重要切入點(diǎn)。大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TanⅡ A)具有抗炎、抗凋亡等多種藥理作用，但其作用機(jī)制尚不完全明確。
　　 本實(shí)驗(yàn)在

3、大鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)所致的腦缺血模型上觀察腦缺血后HMGB1及其相關(guān)受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、Toll樣受體4(toll like receptor4，TLR4)的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，以及TanⅡ A在腦缺血損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其對(duì)HMGB1誘導(dǎo)的核因子-κ

4、B(nuclearfactor kappa B，NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用。
　　 方法：采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、MCAO組、TanⅡ A大劑量組(MCAO+ TanⅡ A20mg/kg，TanⅡA highdose)、TanⅡ A小劑量組(MCAO+ TanⅡA10mg/kg，TanⅡ A low dose)、正常對(duì)照組(Normal)。應(yīng)用Longa等的線栓法建

5、立MCAO大鼠模型。給藥組動(dòng)物梗死后立即腹腔注射10mg/kg或20 mg/kg的丹參酮ⅡA。MCAO組、Sham組和Normal組給予等容量生理鹽水。術(shù)后3h，6h，12 h,24 h,48 h,72h，7d，14 d對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分完畢將動(dòng)物斷頭處死，用干濕重法測(cè)定腦組織含水量，用2％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色法測(cè)算腦梗死體積，用免疫組化、Weste

6、rn Blot和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)來(lái)觀察HMGB1，RAGE，TLR4，NF-κB及claudin-5的表達(dá)情況，應(yīng)用激光掃描共聚焦技術(shù)研究缺血性腦損傷后claudin-5的表達(dá)及ⅠGg的滲出情況。
　　 結(jié)果：
　　 1 MCAO、TanⅡ A大劑量組和TanⅡA小劑量組大鼠均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏癱。Ta

7、nⅡ A大劑量組的神經(jīng)功能評(píng)分低于MCAO組(P＜0.05)。TanⅡ A小劑量組與MCAO組神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2 Sham組和Normal組無(wú)梗死灶。與MCAO組相比，TanⅡA大劑量組梗死體積明顯減小(P＜0.05)，TanⅡA小劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3與MCAO組相比，TanⅡA大劑量組的腦組織含水量明顯下降。TanⅡA小劑量組略有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4腦缺血3h后HMGB1

8、，TLR4，NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，12h后RAGE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)增多，均于24 h達(dá)高峰，48或72 h后逐漸下降，可持續(xù)7d至14d。TanⅡA大劑量組HMGB1，RAGE，TLR4，NF-κBp65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于MCAO組，TanⅡA小劑量組與MCAO組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Western Blot檢測(cè)顯示mRNA表達(dá)的規(guī)律與免疫組化的變化規(guī)律相似；RT-PCR檢測(cè)顯示RAGE，TLR4，NF-κB表達(dá)的規(guī)律與免疫

9、組化及Western Blot變化規(guī)律相似，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而HMGB1在mRNA水平的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5丹參酮ⅡA下調(diào)HMGB1，RAGE，TLR4，NF-κB p65的表達(dá)。腦缺血后，缺血灶周圍腦組織HMGB1，RAGE，TLR4，NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、蛋白水平以及mRNA（除外HMGB1的mRNA水平表達(dá)）表達(dá)水平均上升，給予TanⅡA后，大劑量組較MCAO組HMGB1，RAGE，TLR4，NF-κB p

10、65表達(dá)量明顯減少，TanⅡA小劑量組無(wú)明顯變化。
　　 6丹參酮ⅡA可以改善血腦屏障的通透性。與假手術(shù)組相比，腦缺血后claudin-5表達(dá)明顯下降。RT-PCR以及Western Blot均顯示TanⅡ A可以上調(diào)缺血腦組織內(nèi)claudin-5的表達(dá)，激光掃描共聚焦技術(shù)顯示腦缺血后ⅠGg的滲出明顯增加，應(yīng)用TanⅡ A干預(yù)后大劑量組較MCAO滲出明顯減少，TanⅡ A小劑量組無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：HMGB1，RA