FOXQ1介導TGF-β1-Smad信號通路調控膀胱癌上皮間質轉化的實驗研究.pdf

1、第一部分人膀胱移行細胞癌上皮間質轉化與核轉錄因子FOXQ1的關系
　　目的：探討膀胱移行細胞癌(BTCC)上皮間質轉化與核轉錄因子FOXQ1的相關性,以及FOXQ1與膀胱癌臨床病理特征之間的關系。
　　方法：選用膀胱移行細胞癌手術切除標本65例,每例標本均選用癌組織中心、癌旁組織及其遠端正常粘膜組織對照。采用免疫組織化學、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Westernblot技術檢測各例標本中轉化生長因子TGF-β1、

2、核轉錄因子FOXQ1及上皮間質標記物E-cadherin和Vimentin的表達,并分析與臨床病理因素之間的關系。
　　結果：(1)FOXQ1在BTCC組織中的表達高于正常粘膜組織(89.2％比13.8%,P<0.05),其在肌層浸潤性癌中的表達高于淺表性癌(97.3%比78.6%),在有淋巴結轉移癌中的表達明顯高于無淋巴結轉移癌(100%比86.8%);TGF-β1在BTCC組織中的表達高于正常黏膜(76.9%比26.2%,P<

3、0.05);E-cadherin在BTCC組織中的表達低于正常黏膜(27.7%比89.2%,P<0.05);Vimentin在BTCC組織中的表達高于正常黏膜(83.1%比20.0%,P<0.05)。(2)FOXQ1與E-cadherin表達呈負相關,與TGF-β1、Vimentin表達呈正相關,是EMT的正向調控因子。
　　結論：核轉錄因子FOXQ1與膀胱移行細胞癌分化和轉移有關,可能通過調控上皮間質轉化從而促進膀胱移行細胞癌的

4、侵襲轉移。
　　第二部分短發(fā)夾RNA靶向沉默F(xiàn)OXQ1基因對膀胱癌上皮間質轉化的逆轉作用
　　目的：觀察轉錄因子FOXQ1基因沉默對膀胱癌T24細胞上皮間質轉化的逆轉,探討其在促進腫瘤侵襲轉移的作用機制。
　　方法：構建針對FOXQ1基因的shRNA真核表達載體,脂質體Lipofactamine2000介導FOXQ1干擾質粒轉染人膀胱癌細胞株T24細胞;轉染48h后采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Wester

5、nblot法檢測FOXQ1、上皮間質標記物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達改變;細胞劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測體外細胞遷移和侵襲能力;噻唑藍(MTT)比色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測shRNA對細胞增殖和凋亡的作用。
　　結果：與轉染NC-shRNA陰性對照組比較,轉染FOXQ1-shRNA48h后的T24細胞,FOXQ1和間質標記基因N-cadherin、vi

6、mentin的mRNA或蛋白表達下降,而上皮標記基因E-cadherin的mRNA或蛋白表達顯著增加;轉染后的T24細胞形態(tài)向正常上皮細胞轉化,體外遷移能力與侵襲力下降[(15.4±1.4)%比(76.5±1.1)%,P<0.05];細胞增殖明顯抑制(57.8%比82.7%,P<0.05),同時細胞凋亡率增加(37.6%比14.2%,P<0.05)。
　　結論：靶向沉默F(xiàn)OXQ1基因可以逆轉腫瘤細胞的間質表型,向正常上皮表型轉化,

7、遏制癌細胞遷移和侵襲,降低腫瘤轉移潛能。
　　第三部分FOXQ1介導TGF-β1/Smad信號通路的作用研究
　　目的：觀察FOXQ1基因沉默對TGF-β1誘導的上皮間質轉化的影響,分析TGF-β1和FOXQ1在膀胱癌上皮間質轉化中的作用及信號轉導通路,進一步明確腫瘤侵襲轉移的分子機制。
　　方法：采用脂質體介導的shRNA干擾技術將將真核質粒載體FOXQ1-shRNA和nc-shRNA轉染BIU-87細胞,8小時后給

8、予或不給5ng/mlTGF-β1,建立四組工作細胞系:(nc-shRNA);(nc-shRNA+5ng/mlTGF-β1);(FOXQ1-shRNA);(FOXQ1-shRNA+5ng/mlTGF-β1)。40h后倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,檢測每組細胞FOXQ1的mRNA和蛋白表達情況;實時定量RT-PCR和Westernblot檢測上皮間質標記物E-cadherin,Vimentin。觀察TGF-β1對FOXQ1表達水平和BIU-

9、87細胞形態(tài)表型的調控,及敲低FOXQ1基因后對TGF-β1調控上皮間質標記物表達的影響。
　　結果：(nc-shRNA+5ng/mlTGF-β1)組與(nc-shRNA)組相比,在外源性TGF-β1作用下,膀胱癌BIU-87細胞形態(tài)發(fā)生變化,具有間質表型特征,FOXQ1的mRNA和蛋白表達上調;(FOXQ1-shRNA+5ng/mlTGF-β1)與(nc-shRNA+5ng/mlTGF-β1)組相比FOXQ1的mRNA和蛋白表達