TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通咱中TGFβ1Smad4對膽管癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響.pdf

1、目的: 探討TGFβ1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TGFβ1與Smad4基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞Snail基因、Slug基因、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-Cadherin)以及波形蛋白(Vimentin)表達(dá)的影響，從而界定TGFβ1與Smad4基因?qū)δ懝馨〦MT的作用，為膽管癌的藥物治療提供相關(guān)理論依據(jù)。
　　方法: (1)預(yù)實驗:①采用Western Blot方法驗證Smad4、E-Cadherin和Vimentin在膽管癌細(xì)胞RBE中的內(nèi)源表

2、達(dá)及相應(yīng)抗體的有效性;②考查plvt7慢病毒感染RBE細(xì)胞后的感染效率，篩選感染效率能夠達(dá)到80％以上的最低病毒量作為下一步的實驗條件。(2) Smad4基因干擾載體的構(gòu)建:針對人Smad4基因設(shè)計并合成特異性干擾片段，并將其連接入干擾載體pMagic7.1中，經(jīng)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后經(jīng)293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒干擾載體的包裝，同時構(gòu)建空載體作為陰性對照，并將其感染膽管癌細(xì)胞RBE，檢測其干擾效果，以確定下一步實

3、驗。(3)實驗分組及目的基因和蛋白的檢測:將實驗組分為6組:RBE細(xì)胞組、RNA干擾細(xì)胞組、NC對照組、RBE細(xì)胞+TGFβ1處理組、RNA干擾+TGFβ1處理組、NC對照組+TGFβ1處理組，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用Western Blot和Real time PCR方法分別檢測經(jīng)藥物處理24h和48h時各組Smad4、Snail、Slug、E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)差異。
　　結(jié)果: (1)人膽管癌細(xì)胞RBE中Sm

4、ad4基因的表達(dá)下調(diào)后，Snail和Slug基因的表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)，而E-Cadherin和Vimentin的表達(dá)下調(diào)(p＜0.05）。(2) TGFβ1在細(xì)胞培養(yǎng)液的濃度增加后，人膽管癌細(xì)胞RBE中Smad4、Slug以及Vimentin的表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)，E-Cadherin的表達(dá)下調(diào)(p＜0.05），而Snail基因的表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。(3)人膽管癌細(xì)胞RBE中Smad4基因表達(dá)下調(diào)的同時增加TGFβ

5、1在細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度，Snail、Slug基因的表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)，E-Cadherin的表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)，處理24h時Vimentin的表達(dá)下調(diào)(p＜0.05），處理48h時Vimentin的表達(dá)上調(diào)(p＜0.05）。
　　結(jié)論: TGFβ1可通過TGFβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對膽管癌細(xì)胞EMT的發(fā)生發(fā)揮重要作用，而Smad4參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道無法獨自完成膽管癌EMT的誘導(dǎo)，需與其它信號通道共同誘導(dǎo)膽管癌EMT的發(fā)生，以