AtPAP1基因在煙草中的過表達及花青素合成調控.pdf

1、為實現(xiàn)花青素在煙株中的積累，探索花青素對煙葉品質改良中的應用研究潛力，本文克隆了擬南芥MYB家族轉錄因子PAP1，構建組成型植物過表達載體，采用Ti質粒介導法轉化煙草，實現(xiàn)PAP1基因在煙草及煙草腺毛中的異源過表達，獲得積累花青素的“紅色煙草”。同時，克隆了煙草腺毛特異表達基因CYP71D16的啟動子序列，建立了腺毛特異表達體系，實現(xiàn)了PAP1基因在腺毛中的特異表達，獲得了“紅色腺毛煙草”，為煙草腺毛生物反應器開發(fā)研究奠定了基礎。主要研

2、究結果如下:
　　1.PAP1基因在煙草中組成型表達:克隆PAP1基因插入pCAMBIA1391載體，構建了植物表達載體pC1391-35S-PAP1;在農(nóng)桿菌介導下利用葉盤法轉化煙草T.I1068，在附加2mg/L的PPT篩選壓的MS+6BA1.5+IAA0.1分化培養(yǎng)基上獲得紅色幼芽，并在生根培養(yǎng)基MS+NAA0.1上再生植株。分子檢測證明PAP1基因在煙草中實現(xiàn)了整合和轉錄。轉基因植株葉片中花青素積累，并受到強光誘導。

3、>　　2.煙草腺毛特異表達體系的建立:克隆了煙草腺毛特異表達基因CYP71D16的啟動子序列，并將其插入植物表達載體pCAMBIA1391中，構建了煙草腺毛特異表達載體pCAMBIA1391-CYP-GUS。采用農(nóng)桿菌介導法將該質粒轉化煙草，在附加9mg/L潮霉素(Hyg)的MS+6BA1.5+ IAA0.1分化培養(yǎng)基上篩選到了抗性植株。分子檢測證明，GUS基因在煙草基因組中進行了整合和轉錄。組織化學檢測結果顯示，轉基因植株葉片表面腺毛

4、呈現(xiàn)特異的藍色反應，表明GUS基因在煙草葉面腺毛中成功實現(xiàn)了特異表達。
　　3.PAP1基因在煙草腺毛中的特異表達:構建pCAMBIA1391-CYP-PAP1表達載體，采用葉盤法轉化煙草T.I1068。在附加9mg/L潮霉素(Hyg)的MS+6BA1.5+IAA0.1分化培養(yǎng)基上篩選到了抗性植株。分子檢測證明，PAP1基因在煙草基因組中進行了整合和轉錄;顯微觀察發(fā)現(xiàn)煙草葉片腺毛呈現(xiàn)淺紅色，初步證明花青素在轉基因煙草腺毛中的特異積

5、累。
　　4.轉基因植株的比較分析:對PAP1組成型表達的“紅色煙草”和腺毛特異表達的“紅色腺毛煙草”進行了化學和形態(tài)學分析。LC/MS檢測表明，“紅色煙草”葉片中含有較高的矢車菊色素(Cya)和少量的天竺葵色素(Pel)，“紅色腺毛煙草”葉片中僅含有少量的矢車菊色素(Cya)，而對照T.I1068葉片中不含花青素。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，“紅色煙草”與未轉化煙草對照相比，表型發(fā)生較大變化，葉片呈淺紅色，莖稈彎曲，葉緣卷曲;而“紅色腺毛煙草