促紅細胞生成素衍生肽(HBSP)抑制大鼠心臟缺血-再灌注損傷作用研究.pdf

1、研究背景:
　　冠狀動脈粥樣硬化性心病發(fā)病率在歐美等發(fā)達國家居首位,在我國亦高居第二,其中急性冠脈綜合征的發(fā)病率逐漸上升,并呈現(xiàn)向年輕化發(fā)展的趨勢。如今隨著冠脈介入治療技術(shù)的廣泛開展,為急性冠脈綜合征提供了除溶栓、抗凝等治療之外的多重臨床選擇方案,隨之也增加了心臟缺血/再灌注損傷的發(fā)生率,致使再灌注治療過程發(fā)生嚴重心血管事件的風(fēng)險增加,為血管再通治療帶來挑戰(zhàn)和困境。然而缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusionin

2、jury,I/RI)發(fā)生的機制復(fù)雜,可導(dǎo)致心肌細胞凋亡增加、炎癥反應(yīng)加重及內(nèi)皮功能障礙等一系列病理生理變化,到目前為止其發(fā)生的具體分子機制仍不明確。
　　促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)作為刺激骨髓造血系細胞因子,在臨床上主要應(yīng)用于晚期腎性貧血的治療。大量研究表明,EPO還具有心臟、腎臟、神經(jīng)等多組織器官保護作用。但是由于其能夠促進紅細胞生成,使循環(huán)阻力增大,增加紅了細胞增多癥、高血壓、血管栓塞等患者血栓形成

3、的風(fēng)險,從而使其發(fā)揮細胞保護的作用無法在臨床上得到真正的應(yīng)用。促紅細胞生成素衍生肽(helixBsurfacepeptide,HBSP)是由EPO三級結(jié)構(gòu)衍生而來的多肽,研究顯示其在缺血性心臟和神經(jīng)組織中,表現(xiàn)出與EPO相似的組織保護作用,并證實其無促紅細胞生成的作用。然而HBSP對心臟缺血/再灌注損傷的影響尚未見報道。由此,我們研究HBSP能否對大鼠缺血/再灌注損傷心臟發(fā)揮保護作用,并研究其發(fā)揮心臟保護作用的分子機制。
　　心臟

4、微血管作為心臟組織的重要組成部分,其主要由心臟微血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)心臟發(fā)生I/R損傷時心臟微血管內(nèi)皮細胞可能是首要累及的部位,因此探討HBSP能否對I/RI心臟微血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用具有重要意義。本實驗以大鼠心臟I/RI為模型,研究HBSP對心臟是否具有保護作用,為缺血/再灌注治療提供新的思路,并為HBSP的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1.驗證HBSP能否對大鼠缺血/再灌注損傷心臟發(fā)揮保護作用,

5、并與EPO保護作用相比較。
　　2.探討HBSP對再灌注損傷心肌的重要作用及其機制。
　　3.觀察HBSP對缺血/再灌注損傷心臟微血管內(nèi)皮細胞的作用。
　　實驗方法:
　　1.用200~250g雄性SD大鼠,結(jié)扎冠狀動脈前降支,缺血30min后,恢復(fù)冠狀動脈血流灌注,再灌注前5min分別尾靜脈注射生理鹽水、rhEPO(人重組促紅細胞生成素)、HBSP,制備缺血/再灌注模型。
　　2.實驗分組:假手術(shù)(Sha

6、m)組、缺血/再灌注(I/R)組、促紅細胞生成素(EPO)組、HBSP組及HBSP+LY294002(PI3k特異性抑制劑,于再灌注前15min靜脈注射)組。
　　3.經(jīng)右頸動脈插管至左心室,檢測再灌注3h內(nèi)血流動力學(xué)指標:左室收縮壓(LeftVentricularSystolicPressure,LVSP)和左室內(nèi)壓力變化微分(±LVdp/dt)。采用小動物超聲分別檢測24h、1w后大鼠心功能,并檢測24h大鼠血液紅細胞數(shù)目。<

7、br>　　4.再灌注3h后,再次結(jié)扎冠狀動脈前降支,采用TTC-Evansblue雙染法測定梗死面積。
　　5.取心臟組織,切片TUNEL/DAPI熒光標記,利用激光共聚焦顯微鏡檢測心肌細胞凋亡。Westernblot法檢測心肌組織蛋白激酶B(Akt)和磷酸化Akt的表達。
　　6.用150~200g雄性SD大鼠,分離培養(yǎng)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞(cardiacmicrovascularendothelialcell,CMEC

8、),制備模擬缺血/再灌注(缺氧/復(fù)氧)模型。
　　7.實驗分組:對照組(Control);模擬缺血/再灌注(simulatedischemiareperfusion,SI/R)組;模擬缺血/再灌注+HBSP(SI/R+HBSP)組。
　　8.復(fù)氧3h后MTT法檢測CMECs細胞活力,TUNEL法檢測細胞凋亡。
　　實驗結(jié)果:
　　1.本實驗以心電Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST段抬高性心電圖,作為心肌缺血的標志,直至再灌注觀測終止

9、時間。
　　2.血流動力學(xué)指標檢測結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,缺血/再灌注損傷大鼠心功能明顯降低。與I/R組相比,EPO組和HBSP組再灌注前分別靜脈給予rhEPO、HBSP后,再灌注3h,大鼠心臟左室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)以及最大下降速率(-dp/dtmax)顯著升高。
　　3.小動物超聲檢測結(jié)果顯示:與Sham組比較,I/R大鼠24h、1w后心功能指標均有不同程度的降低趨勢。與I/R

10、組相比,EPO組和HBSP組再灌注24h、1w后左室射血分數(shù)(LVEF％)、室間隔厚度(IVSS)及左室短軸縮短率(FS%)顯著增加,24h后檢測大鼠血液紅細胞顯示HBSP無促紅細胞生成的作用。
　　4.再灌注3h后,TTC-Evansblue雙染法梗死面積檢測結(jié)果顯示,與I/R組相比,EPO組和HBSP組心肌梗死面積明顯縮小。
　　5.用TUNEL/DAPI熒光標記,利用激光共聚焦顯微鏡檢測再灌注3h后心肌細胞凋亡,與Sh

11、am組相比,缺血/再灌注損傷心肌細胞凋亡顯著增加;與I/R組相比,EPO組和HBSP組心肌細胞凋亡顯著減少;HBSP+LY294002組與HBSP組相比,心肌細胞凋亡顯著增加。EPO組和HBSP組間無差異。
　　6.再灌注3h后,Westernblot檢測Akt和磷酸化Akt的表達,與I/R組相比,HBSP組Akt磷酸化水平顯著提高。HBSP+LY294002組與HBSP組相比,Akt磷酸化水平明顯降低。
　　7.復(fù)氧3h后

12、,MTT法檢測各組細胞活力,與對照組相比,SI/R細胞增殖能力明顯降低。與SI/R組相比,HBSP+SI/R組CMECs增值能力明顯升高。
　　8.細胞爬片固定,各組給予相應(yīng)處理后,TUNEL法檢測細胞凋亡,與對照組相比,SI/R組和SI/R+HBSP組CMECs凋亡明顯增多;與SI/R相比,SI/R+HBSP組細胞凋亡明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.在大鼠缺血/再灌注3h內(nèi),HBSP能明顯改善心臟收縮、舒張功能;并在