促紅細胞生成素對離體大鼠心臟缺血再灌注損傷保護作用的研究.pdf

1、研究背景：缺血和再灌注可嚴重破壞心肌細胞超微結構，阻礙心肌組織能量代謝，導致心肌細胞凋亡和壞死，降低缺血再灌注損傷后心肌收縮和舒張功能。預處理(缺血或藥物)是目前研究最為廣泛，用于減輕心肌缺血再灌注損傷的主要手段。本研究通過建立大鼠離體心臟Langendorff模型，以重組人促紅細胞生成素預灌注作為處理手段，觀察thEPO預處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用；同時，通過測定磷酸化PKCε、p38MAPK和ERK1/2的表達，探討thEP

2、O心肌保護的可能分子機制。
　　 第一部分促紅細胞生成素預處理對大鼠缺血再灌注損傷后心功能的保護作用
　　 目的：研究thEPO預處理對心肌缺血再灌注損傷后心肌收縮和舒張功能以及細胞活性的影響。
　　 方法：
　　 本實驗采用全心缺血30分鐘，再灌注120分鐘模擬心肌缺血再灌注模型(I/R模型)。分別測定I/R組、thEPO(10IU/ml)+I/R組、chelerythrine+rhEPO+I/R組、S

3、B203580+rhEPO+ IUR組. PD98059+rhEPO+ I/R組/glibenclamide+rhEPO+ I/R組和L-NAME+rhEPO+I/R組(共7組)缺血前、再灌注30分鐘、再灌注60分鐘及再灌注120分鐘時的LVDP、RPP、+dP/dtmax、-dP/dtmax和CF以評測心肌收縮和舒張功能；應用MTT比色法測定各組心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞活度。
　　 結果：
　　 1.RhEPO預處

4、理大鼠心臟再灌注30分鐘的LVDP、RPP和±dP/dtmax，60、120分鐘的LVDP、RPP、±dP/dtmax和CF值以及OD550均較I/R組顯著升高。
　　 2.Chelerythrine和thEPO聯(lián)合預處理后，大鼠心臟再灌注30分鐘的LVDP、RPP和-dP/dtmax，60、120分鐘時的LVDP、RPP、±dP/dtmax以及心肌細胞活性均較thEPO處理組顯著下降。SB203580或PD98059與thEP

5、O聯(lián)合預處理后，再灌注30分鐘的LVDP、RPP和士dPidtmax，60、120分-鐘的LVDP、RPP、±dP/dtmax和CF以及OD550均較thEPO處理組顯著下降。
　　 3.Glibenclamide和thEPO聯(lián)合應用后，大鼠心臟再灌注30分鐘的LVDP、RPP和士dP/dtmax，60、120分鐘的LVDP、RPP、±dP/dtmax和CF以及OD550均較thEPO處理組顯著下降。
　　 4.L-NA

6、ME和thEPO聯(lián)合應用后，大鼠心肌其再灌注30分鐘、60分鐘及120分鐘的LVDP、RPP、±dP/dtmax、CF以及OD550各項指標均較thEPO處理組顯著下降。
　　 結論：
　　 RhEPO預處理能顯著提高大鼠心肌缺血再灌注損傷的左心收縮和舒張功能，增加冠脈流量并提高心肌細胞存活率，其機制與PKC8、p38MAPK或ERK1/2的磷酸化激活有關，抑制PKC、p38MAPK或ERK1/2途徑活化均可完全阻斷th

7、EPO上述心肌保護作用。RhEPO預處理的心肌保護作用還與KATP通道的活化和開放有關，抑制KATP通道的開放可完全阻斷thEPO的心肌保護作用。此外，NO的合成和釋放也是介導thEPO預處理心肌保護的必要因素，阻斷NOS、抑制NO的合成和釋放可完全阻斷thEPO的心肌保護作用。
　　 第二部分促紅細胞生成素預處理對大鼠缺血再灌注損傷的急性心肌保護的機制研究
　　 目的：探討thEPO預處理心肌保護的相關分子機制。

8、>　　 方法：
　　 采用Westem-blot技術分別測定對照組、thEPO(10IU/ml)預處理、Chelerythrine+rhEPO預處理、SB203580+rhEPO預處理、PD98059+rhEPO預處理、Glibenclamidee+rhEPO預處理和L-NAME+rhEPO預處理(共7組)后心肌組織磷酸化PKC8、p38MAPK和ERKI/2的表達。
　　 結果：
　　 1.RhEPO(10I

9、U/ml)預灌注10分鐘后，心肌細胞顆粒成份(主要為線粒體、細胞核和胞膜成份)內PKCs含量較對照組顯著升高，而細胞漿內PKCε含量卻顯著減少。同時，磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2也均較對照組顯著升高。
　　 2.PKC抑制劑chelerythrine可完全阻斷PKC￡活化和轉位，心肌細胞顆粒成份內PKC8含量較thEPO處理組顯著減少并回落至基礎水平。而p38MAPK抑制劑SB203580和ERK1/2抑制劑PD98

10、059對PKCε的活化和轉位無顯著影響。
　　 P38MAPK抑制劑SB203580可完全抑制磷酸化p38MAPK表達；chelerythrine可部分抑制磷酸化p38MAPK表達；而PD98059對p38MAPK磷酸化表達無顯著影響。
　　 ERK1/2抑制劑PD98059可完全抑制磷酸化ERK1/2的表達；chelerythrine可部分抑制磷酸化ERK1/2的表達；而SB203580對ERKI/2的磷酸化表達無顯著

11、影響。
　　 3.廣譜KATP通道抑制劑glibenclamide與thEPO聯(lián)合灌注對PKCε的活化和轉位無顯著影響，卻能部分阻斷磷酸化p38MAPK和ERKl/2的表達。
　　 4.廣譜一氧化氮合酶抑制劑L-NAME與thEPO聯(lián)合灌注均能部分減少PKC8、p38MAPK和ERK1/2的磷酸化激活。
　　 結論：
　　 RhEPO(10U/ml)預灌注可快速磷酸化激活PKC8，并促使其由細胞漿向細胞顆

12、粒成份內轉移，并快速磷酸化激活p38MAPK和ERK1/2。PKC8是p38MAPK和ERK1/2的上游激酶，阻斷PKC￡可部分減少磷酸化p38MAPK和ERK1/2的表達。
　　 抑制KAIP通道的活化和開放并不影響PKCε的活化和轉位.卻能部分阻斷p38MAPK和ERK1/2的磷酸化表達。可見， PKCε可能是KATP通道的上游激酶；而p38MAPK和ERK1/2是KATP通道的下游激酶，p38MAPK和ERK1/2的磷酸化