白藜蘆醇苷對大鼠鞘內注射羅哌卡因神經毒性的影響.pdf

1、目的： 局麻藥(localanesthetics，LA)系臨床麻醉常用的藥物，其具有直接或間接的周圍神經毒性作用，臨床表現分為永久性和短暫性的神經損傷。目前關于LA周圍神經毒性損傷機理尚未完全清楚，較肯定的為其與LA的濃度、劑量、腦脊液中的濃聚、神經系統(tǒng)暴露于LA的時間等密切相關。就此LA周圍神經毒性損傷途徑而言，臨床已采取相應防治措施，但并未取得確切效果，且無流行病學資料證明可降低其發(fā)生率。因而近年國內外學者研究探討應用藥物防

2、治LA對周圍神經的毒性作用。 鑒于上述現狀，藥物防治LA周圍神經毒性損傷成為關注的焦點。綜合文獻報道，目前正在研究的藥物主要分為四大類：①神經營養(yǎng)因子。該領域研究僅局限于離體細胞培養(yǎng)實驗階段，并顯示出一定的神經保護作用，但在體實驗能否出現同樣的結果，前景不明。②興奮性氨基酸谷氨酸受體拮抗劑。在體及離體實驗結果證實，其主要通過拮抗a-氨基羥甲基惡唑丙酸(a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-pro

3、pionicacid，AMPA)受體發(fā)揮神經保護作用，但并不能完全消除神經毒性損傷。③絲裂原性活化蛋白激酶抑制劑(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)。MAPK屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶大家族，主要包括細胞外信號調節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinases，ERKs)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-teminalkinases，JNKs)和p38激酶。部分

4、學者通過探討LA周圍神經毒性損傷與信號轉導間的關系，發(fā)現LA可通過誘導MAPK相關的信號轉導系統(tǒng)導致神經細胞凋亡，同時發(fā)現p38激酶抑制劑對利多卡因所致神經毒性損傷具有神經保護作用，減少神經細胞凋亡。④中草藥類。國內學者經離體脊髓神經元細胞培養(yǎng)研究發(fā)現參附注射液對布比卡因引起的神經毒性具有一定的保護作用，然而機理不清，且在體實驗保護效果如何，尚無實驗研究予以證實。 白藜蘆醇苷(polydatin，PD)為天然白藜蘆醇(resve

5、ratrol，Res)的葡萄糖苷形式，前者在體內水解為Res而發(fā)揮藥理作用。研究發(fā)現Res可減輕外傷性脊髓損傷，促進神經再生及功能恢復。Res上述作用可否應用于防治LA引起的周圍神經毒性損傷，尚無研究證實。 本實驗采取大鼠靜脈注射高純度中藥單體PD，通過感覺、運動功能評分與光鏡組織形態(tài)學觀察，初步判斷其對大鼠鞘內注射2％羅哌卡因引起的神經毒性損傷是否具有保護效應。 方法： 1、制備SD大鼠蛛網膜下腔給藥模型

6、 成年SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛(100mg/kg)麻醉。將PE-10導管消毒封存?zhèn)溆谩４笫笕「┡P位，于背部正中線L3～L4間隙處作長約2cm的皮膚縱切口，暴露上、下關節(jié)突間黃韌帶。提起下位棘突，以7號針頭探查，穿破黃韌帶、硬脊膜及蛛網膜，以鼠尾突然出現側擺或后腿抽動為成功標志。經破口向尾側置入PE-10導管2cm，固定、縫扎導管。導管置于皮下，縫合切口。大鼠術畢肌注青霉素鈉，注意保溫，單籠飼養(yǎng)2d，每日檢查有無脊髓神經損傷及局部

7、感染表現，如出現感覺與運動異常表現，則予以剔除。 2、實驗分組 選取鞘內置管成功大鼠50只，隨機分5組(n=10)。NS組經PE-10導管鞘內注入生理鹽水4μl(對照組)；R組鞘內注入2％羅哌卡因40μl；R+PD1、R+PD2、R+PD3組分別經股靜脈注射PD(5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg)，容量均為0.75ml/100g，其后鞘內注射2％羅哌卡因40μl。各組大鼠右側頸內動脈穿刺置管持續(xù)監(jiān)測平均動脈壓

8、(meanarterialpressure，MAP)，若MAP<60mmHg，可經股靜脈緩慢靜滴0.9％生理鹽水補液。 數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，各組大鼠體重、蛛網膜下腔置管時間以均數±標準差(-x±s)表示，組內比較采用完全隨機設計資料的單向方差分析(One-wayANOVA)。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。 3、給藥后7d大鼠行感覺、運動功能評分 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處

9、理，各組感覺、運動功能評分比較均采用多個獨立樣本非參數檢驗(Kruskal-Wallistest)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。感覺與運動功能評分組間兩兩比較采用兩獨立樣本非參數檢驗(Mann-WhitneyU-test)，并采用Bonferroni法校正檢驗水準α，校正后的檢驗水準為α=0.005，P≤0.005為差異具有統(tǒng)計學意義。 4、灌注固定、取材、光鏡觀察組織結構改變 大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，鞘

10、內注射6μl亞甲藍以確認導管尖端位置。開胸，暴露心臟，灌流針于左心室穿刺至升主動脈，先以37℃的生理鹽水300ml沖灌，直至體循環(huán)血液沖洗干凈，流出清亮的灌流液為止。換冷(4℃)4％多聚甲醛(0.1mol/L，pH7.35)500ml灌流固定40min～1h。于置管位置以蚊鉗咬開椎板，分離尾段脊髓(脊髓圓錐以上)及10mm馬尾神經(脊髓圓錐以下)固定于4％多聚甲醛中24h，再置于脫鈣液中24h。行石蠟切片，蘇木素-伊紅(Hematoxy

11、linandEosin，HE)染色，光學顯微鏡下觀察脊髓、神經根、馬尾神經、背根神經節(jié)等組織結構改變并進行損傷評分。 數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，各組損傷評分比較采用多個獨立樣本非參數檢驗(Kruskal-Wallistest)，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。損傷評分組間兩兩比較采用兩獨立樣本非參數檢驗(Mann-WhitneyU-test)，并采用Bonferroni法校正檢驗水準α，校正后的檢驗水準為α

12、=0.005，P≤0.005為差異具有統(tǒng)計學意義。 結果： 1、所有實驗大鼠體重(227±12)g，P=0.996(P>0.05)，各組差異無統(tǒng)計學意義。 2、所有大鼠蛛網膜下腔置管術手術時間為(30±4)min，P=0.427(P>0.05)，各組差異無統(tǒng)計學意義。手術切口局部無感染。每日觀察未見脊髓神經損傷表現。 3、大鼠蛛網膜下腔注射給藥的可靠性 (1)鞘內注射6μl亞甲藍，打開椎管，暴露脊

13、髓，發(fā)現導管均位于蛛網膜下腔內。 (2)鞘內注射2％羅哌卡因4μl，大鼠全部出現雙下肢麻痹，鉗夾雙上肢躲避反射存在，而雙下肢無反應，夾尾反射消失，證明藥物已在脊髓起作用。 4、大鼠鞘內給藥后MAP均顯著下降，但均高于60mmHg，未行靜脈補液。大鼠蘇醒后單籠飼養(yǎng)。 5、各實驗組大鼠給藥后第7d，感覺功能評分平均秩次R組>R+PD1組>R+PD3組>R+PD2組>NS組，采用多個獨立樣本非參數檢驗(Kruskal-

14、Wallistest)，P=0.000，各組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步組間多重比較(Mann-WhitneyU-test)，發(fā)現NS與R、NS與R+PD1、R與R+PD2、R+PD1與R+PD2之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.005)，其余各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.005)。即NS組感覺功能評分低于R及R+PD1組。R+PD2組感覺功能評分低于R、R+PD1組。 6、各實驗組大鼠給藥后第7d運動功能評分未見

15、明顯改變。 7、光學顯微鏡下觀察大鼠鞘內注射2％羅哌卡因神經毒性損傷的主要部位為脊髓白質背索、脊神經根、馬尾神經。輕度損傷可見局部水腫，重者可見神經軸突退行性變，包括軸突腫脹空泡化，萎縮，軸突消失，甚至巨噬細胞浸潤。脊髓灰質前角運動神經元改變并不明顯，局部少許可見神經元染色質溶解，未出現特征性的脊髓前角運動神經元的改變。 8、各實驗組大鼠神經損傷評分平均秩次R組>R+PD1組>R+PD3組>R+PD2組>NS組，采用多個

16、獨立樣本非參數檢驗(Kruskal-Wallistest)，P=0.000，各組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步組間多重比較(Mann-WhitneyU-test)，發(fā)現NS與R、NS與R+PD1、R與R+PD2、R與R+PD3、R+PD1與R+PD2之間差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.005)，其余各組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.005)。即NS組神經損傷評分低于R、R+PD1組，R+PD2組神經損傷評分低于R、R+PD1組，R+

17、PD3組神經損傷評分低于R組。 結論： 1、成功制備大鼠鞘內給藥動物模型。改進的大鼠蛛網膜下腔給藥模型置管成功率高，損傷小，未發(fā)生脫管，為下一步實驗奠定了良好的基礎。 2、大鼠鞘內注射2％羅哌卡因神經毒性損傷明確。損傷部位主要累及脊髓白質背索、脊神經根、馬尾神經，而脊髓灰質神經元、背根神經節(jié)等未見明顯改變。光學顯微鏡下觀察主要表現為局部充血水腫，神經軸突退行性變，即軸突腫脹空泡化、萎縮、軸突消失、甚至巨噬細胞浸潤