脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維支架材料修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨缺乏直接的血液供應(yīng)、淋巴循環(huán)和神經(jīng)支配，代謝能力低，自身難以修復(fù)，而目前臨床常用的修復(fù)方法均有一定局限性，脫細(xì)胞基質(zhì)以其良好的生物相容性、細(xì)胞吸附性及良好的親水性，成為組織工程支架選擇的又一亮點。與人工材料相比，天然材料的優(yōu)點是生物相容性好、結(jié)構(gòu)成分與ECM相似，適合種子細(xì)胞的生長、增殖及分化，與其他天然仿生材料相比，由于軟骨細(xì)胞ECM生化成分與結(jié)構(gòu)復(fù)雜，脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料可以更加接近軟骨組織的復(fù)雜天然結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性。本研究通

2、過制備脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損。
　　第一部分，脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維支架的制備及特性研究
　　目的：探索脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架的制備及其特性研究。
　　方法：新鮮牛膝關(guān)節(jié)軟骨粉碎后，梯度離心法獲取軟骨微粒，采用改進的Courtman改良法處理細(xì)胞后，再冷凍干燥，制備脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維多孔支架。然后，采用京尼平對三維支架進行交聯(lián)，再次冷凍干燥后，對支架材料進行大體、組織學(xué)染色及掃描電鏡觀察，分別測定支

3、架的孔隙率、溶脹率、降解率。
　　結(jié)果：大體觀察示支架呈疏松多孔狀，京尼平交聯(lián)后整體呈深藍色。組織學(xué)觀察示支架材料無軟骨細(xì)胞碎片殘留，蘇木精-伊紅（HE）染色，甲苯胺蘭染色觀察均未見軟骨細(xì)胞殘留。掃描電鏡顯示支架內(nèi)孔洞較明顯。測量示支架孔隙率為90％，溶脹率為（1314±337）％，降解率2周為（13.69±7.3）％，4周為（25.99±8.9）％。
　　結(jié)論：經(jīng)改進的Courtman改良法處理的軟骨基質(zhì)三維多孔支架脫細(xì)胞

4、更徹底，保留了軟骨的天然細(xì)胞外基質(zhì)成分，天然交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)后支架材料機械強度和抗降解性得到了提高。
　　第二部分，脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維支架的生物相容性研究
　　目的：運用兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）接種于支架上評價支架的生物相容性。
　　方法：原代培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs），傳至第二代后以2.0×106個/ml的細(xì)胞濃度接種于支架上，采用MTT法檢測BMSCs在支架材料上后1、3、5、7、9d的生長、增殖情況，并

5、描繪出柱形圖。1w后掃描電鏡觀察兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞于支架上的黏附情況。
　　結(jié)果：MTT法顯示細(xì)胞在支架上生長良好，與對照組DMEM培養(yǎng)液吸光度值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示支架無細(xì)胞毒性。掃描電鏡顯示1w后BMSCs通過細(xì)胞突起黏附于支架表面，黏附良好，能較好地在其上生長。
　　結(jié)論：天然交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)后支架的細(xì)胞生物相容性好，細(xì)胞在材料上能很好的黏附和生長增殖，可作為骨軟骨組織工程的良好載體。
　　第

6、三部分，脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維支架復(fù)合bBMP后修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損
　　目的：運用制備好的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損。
　　方法：用鹽酸胍溶液溶解bBMP，將脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)支架浸泡于此溶液中，包于透析膜內(nèi)，蒸餾水透析4d后冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用。掃描電鏡觀察復(fù)合bBMP后支架的結(jié)構(gòu)以及BMSCs接種9d后在支架上的生長狀況。取日本大耳兔12只，在其股骨髁部造成一直徑4mm深達骨髓腔的缺損，其中18個膝蓋植入

7、復(fù)合有bBMP的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)支架，作為實驗組，剩余的6個膝蓋曠置為空白對照組。術(shù)后12w，24w取材，大體觀察及HE、甲苯胺蘭組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果：掃描電鏡觀察可見9d后復(fù)合體材料表面有大量細(xì)胞黏附生長，并連接成片狀覆蓋于支架表面，細(xì)胞生長旺盛，廣泛分布于支架上。12w，實驗組缺損處可見白色組織大部分覆蓋于缺損表面，與周圍正常組織界限不明顯，組織學(xué)觀察為新生軟骨，能見到透明軟骨結(jié)構(gòu)及軟骨下骨結(jié)構(gòu)，支架基本降解；對照組缺損明顯，

8、以纖維樣組織填充于缺損部位。24w，實驗組缺損處可見白色組織基本完全覆蓋于缺損表面，與周圍正常組織界限基本消失，組織學(xué)觀察為新生透明軟骨，結(jié)構(gòu)層次分明，并與軟骨下骨連接緊密；對照組為纖維樣組織修復(fù)，缺損仍然明顯。
　　結(jié)論：在體內(nèi)關(guān)節(jié)腔和骨髓腔不同的微環(huán)境誘導(dǎo)下，復(fù)合bBMP的脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)支架材料能對兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損達到較好的修復(fù)效果，為骨軟骨組織工程修復(fù)提供了又一方法。
　　實驗結(jié)果表明，脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)三維支架材料改進的