合成Ⅱa類廣譜細菌素乳酸菌的篩選及合成和分離的研究.pdf

1、Ⅱa類細菌素是一種對單增李斯特氏菌具有強烈的抑菌活性，且在N端具有YGNGVXCXXXXCXV保守序列的細菌素，乳酸菌產生的Ⅱa類細菌素由于具有抑菌譜廣、穩(wěn)定性高、分散性好、安全高效、能作為天然防腐劑等優(yōu)點而倍受關注。但乳酸菌產生的廣譜Ⅱa類細菌素的傳統(tǒng)篩選方法的費時、費力、不能直接鑒定為Ⅱa類細菌素，分離純化步驟繁瑣，生物合成量低是限制其產業(yè)化的三大瓶頸。如果能夠建立一種快速簡捷的篩選方法直接鑒定Ⅱa類細菌素、縮短分離純化步驟、提高其

2、生物合成量，對Ⅱa類細菌素的產業(yè)化應用具有重要意義。
　　本論文以實驗室前期收集、篩選保存的乳酸菌為研究對象，對其進行了具有廣譜抑菌活性乳酸菌細菌素的篩選，建立了直接鑒定Ⅱa類乳酸菌細菌素的平臺，提高了篩選得到的具有廣譜抑菌作用的Ⅱa類乳酸菌細菌素的生物合成量，建立了Ⅱa類乳酸菌細菌素的新的快速分離工藝，研究了Ⅱa類乳酸菌細菌素的理化性質。
　　利用瓊脂擴散法對實驗室保存的142株乳酸菌進行了具有廣譜抑菌活性的產細菌素乳酸菌

3、的篩選，經過排除有機酸、過氧化氫及蛋白酶驗證，最終篩選出菌株IN3432、Y31、Y33、IN3521、IN3922、SP1.1、94.3、IN3821共8株乳酸菌具有產廣譜乳酸菌細菌素的能力。
　　基于Ⅱa類細菌素在N端具有YGNGVXCXXXXCXV保守序列的特征，建立了基于YGNGV-位點的直接鑒定產Ⅱa類細菌素乳酸菌的高通量篩選平臺；利用此平臺從上述8株產細菌素的乳酸菌中鑒定出3株乳酸菌（Y33、Y31、SP1.1）具有產

4、Ⅱa類細菌素的能力。其中菌株Y31和菌株Y33與Genebank數據庫中的Ⅱa類細菌素的基因編碼序列同源性最高，綜合菌株 Y31的抑菌活性最強且相對更為穩(wěn)定，所以選擇菌株Y31進行后續(xù)進一步的研究。經菌落、菌體形態(tài)、API生理生化及16S rDNA鑒定菌株 Y31為屎腸球菌 Enterococcus faecium。
　　利用化學定義培養(yǎng)基來培養(yǎng)產Ⅱa類細菌素乳酸菌 Enterococcus faecium Y31，不添加任何蛋白

5、質和肽，單純通過調節(jié)各種化學定義培養(yǎng)基的純的氨基酸成分、維生素和礦物質等成分，提出了一個能提高細菌素Enterocin Y31產量的新方法；研究結果表明產Ⅱa類細菌素乳酸菌Enterococcus faecium Y31的生長與細菌素Enterocin Y31產量沒有直接的線性關系；利用缺一交叉試驗確定了提高細菌素 Enterocin Y31產量的新的化學定義培養(yǎng)基 SDM；比較 SDM中Enterocin Y31的產量和MRS中Ent

6、erocin Y31的產量，發(fā)現SDM中EnterocinY31的產量是MRS中Enterocin Y31的產量的1.6倍。
　　發(fā)現了利用化學定義培養(yǎng)基-超濾聯(lián)合優(yōu)化Ⅱa類細菌素生物合成量后，細菌素Enterocin Y31的分離純化更為簡便，僅為超濾和電泳兩步，并將其新的分離純化方法與常規(guī)的分離純化方法（細胞膜吸附、離子交換色譜、透析、疏水層析、反向色譜）純度和得率進行了比較，化學定義培養(yǎng)基-超濾的回收率為80％，而常規(guī)的分離

7、純化方法為6.4%，化學定義培養(yǎng)基-超濾方法比常規(guī)方法提高了12.5倍，純度都達到了質譜測序要求，化學定義培養(yǎng)基-超濾聯(lián)合的方法避免了Enterocin Y31下游加工的損耗和在分離純化過程中多步驟帶來的活性完全喪失的風險，具有顯著的優(yōu)勢。Enterocin Y31的分子量是6.7kDa,含有10種氨基酸，其中Met含量最高，部分氨基酸序列是N-T-A-H-S-D-F-N-R。
　　開展了細菌素Enterocin Y31抑菌譜及理

8、化性質的研究，結果表明Enterocin Y31具有廣譜的抑菌活性，其中對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ATCC6633、大腸桿菌 Escherichia coli ATCC25922、李斯特氏菌 Listeria monocytogenes ATCC19111、梭狀芽孢桿菌 Bacillus cereus CICC20463、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus有較強的抑制作用，對沙門氏菌 Sal

9、monella enterica serovar Typhimurium ATCC14028有較弱的抑制作用。Enterocin Y31等電點為8.25。Enterocin Y31在酸性和弱堿性環(huán)境下穩(wěn)定、有一定的熱穩(wěn)定性、對蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感，不能被脂肪酶和α-淀粉酶水解。Enterocin Y31對無機鹽NaCl、蛋白酶抑制劑EDTA和三種去污劑有一定的承受能力，其中降低細菌素抑菌活性最明顯的是1.0%SD