一種新型Ⅱa類(lèi)乳酸菌細(xì)菌素的重組表達(dá)策略研究.pdf

1、Ⅱa類(lèi)細(xì)菌素是乳酸菌細(xì)菌素的一個(gè)亞類(lèi)，為抗李斯特氏菌的多肽，對(duì)熱穩(wěn)定；可被人體生物降解和消化，對(duì)健康無(wú)害，是一類(lèi)控制李斯特氏菌污染最具潛力的抗菌肽，對(duì)食品保藏具有重要意義。因此Ⅱa類(lèi)細(xì)菌素的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。
　　 到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的20多種Ⅱa類(lèi)細(xì)菌素大多采用傳統(tǒng)的篩菌方法和繁瑣的分離純化得到，存在干擾因素多，產(chǎn)量低，分離純化困難等問(wèn)題，故很難再迅速挖掘出新的Ⅱa類(lèi)細(xì)菌素。鑒于這類(lèi)細(xì)菌素序列的保守性，利

2、用基因組學(xué)和生物信息學(xué)來(lái)尋找新的細(xì)菌素已成為一種有效的工具；而細(xì)菌素的異源表達(dá)則克服了產(chǎn)生菌細(xì)菌素調(diào)控系統(tǒng)的制約，使其可以連續(xù)生產(chǎn)或超量表達(dá)。所采用的表達(dá)系統(tǒng)主要是大腸桿菌系統(tǒng)、乳酸菌系統(tǒng)和酵母菌系統(tǒng)，其中大腸桿菌系統(tǒng)最常用，表達(dá)的細(xì)菌素主要以胞內(nèi)融合的包涵體形式存在，其后續(xù)的處理過(guò)程較為復(fù)雜繁瑣。近年來(lái)，一種無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)發(fā)展迅速，成功地架起了基因與蛋白質(zhì)之間的橋梁，能使外源基因在體外快速表達(dá)，并且避免了細(xì)胞體系中宿主菌的復(fù)雜調(diào)

3、控和新陳代謝帶來(lái)的干擾，以及基因工程菌表達(dá)抗菌肽時(shí)對(duì)宿主的毒性作用。因此，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)將成為Ⅱa類(lèi)細(xì)菌素重組表達(dá)的一種有效手段。
　　 本文以通過(guò)基因組學(xué)和生物信息學(xué)工具挖掘到的一條潛在的Ⅱa類(lèi)細(xì)菌素基因NB-C1為研究對(duì)象，進(jìn)行不同策略的重組表達(dá)研究，從而實(shí)現(xiàn)NB-C1基因的高效活性表達(dá)，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行鑒定。首先構(gòu)建了NB-C1基因的表達(dá)載體pIVEX2.4d-NB-C1以及帶綠色熒光蛋白（GFP）和硫氧還蛋白（T

4、rxA）標(biāo)簽的融合表達(dá)載體pIVEX2.4d-GFP-NB-C1和pIVEX2.4d-TrxA-NB-C1。將各表達(dá)載體分別在大腸桿菌系統(tǒng)（BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS）和大腸桿菌無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，其中pIVEX2.4d-GFP-NB-C1在體內(nèi)和體外系統(tǒng)均成功表達(dá)出可溶性的融合蛋白，可溶性蛋白的表達(dá)量分別為體內(nèi)表達(dá)量840 μg/mL，體外表達(dá)量730 μg/mL（間歇式反應(yīng)，Batch-mode）和

5、2.2 mg/mL(連續(xù)交換式反應(yīng)，CECF-mode)；pIVEX2.4d-TrxA-NB-C1在體內(nèi)表達(dá)的融合蛋白以胞內(nèi)包涵體形式存在，在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中則能實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，但表達(dá)量較低。將體內(nèi)和體外表達(dá)的GFP-NB-C1進(jìn)行Ni-NTA親和層析柱純化后，分別得到純度95％和98％的融合目的蛋白36 mg/L和0.26 mg/mL。以單核增生李斯特氏菌為指示菌，檢測(cè)各表達(dá)產(chǎn)物的抑菌活性，結(jié)果表明可溶性表達(dá)的NB-C1融合蛋白均表現(xiàn)出對(duì)