單精注射制備轉基因豬胚胎技術的研究.pdf

1、轉基因動物研究開始于上個世紀七十年代末，是一項能對家畜基因組進行修飾的有效技術，對改進畜牧業(yè)生產效率有重大的作用。目前轉基因技術有原核注射法、精子介導法、逆轉錄病毒感染法和體細胞移植法等。將精子載體轉基因法(SMGT)與單精注射(ICSI)結合制備轉基因動物是一種新的轉基因技術，研究歷史較短，但其可行性和高效性已在多個物種得到試驗證實。BAC作為轉基因載體，可攜帶的基因包括上下游調控序列，可以和轉錄酶、轉錄因子等作用，轉基因將能遵守基因

2、固有的表達機制。所以將ICSI-SMGT技術與BAC轉基因技術相結合制備轉基因豬，為我們今后制備大片段轉基因豬提供了新方法，具有廣闊的應用前景。為成功制備轉基因豬胚胎，本課題將從豬卵母細胞延遲保存與體外培養(yǎng)和以單精注射技術與BAC載體技術相結合為目標的兩個方面進行研究。
　　第一方面，建立豬卵母細胞體外延遲保存體系，擬設計先將卵母細胞分別放入TCM199（含HEPE）、PBS緩沖液（無Ca2+和Mg2+）和DMEM低糖培養(yǎng)基中37

3、℃保存6-8h后轉入成熟培養(yǎng)液與瞬時放入成熟培養(yǎng)液的對照組作比較，統(tǒng)計分析試驗組之間成熟率，卵裂率和囊胚率的差別。其中對照組成熟率為78.19％，卵裂率為55.87％和囊胚率尾12.23％; TCM199試驗組成熟率為76.25％，卵裂率為55.00％和囊胚率為12.12％; PBS試驗組成熟率為49.00％，卵裂率為22.00％和囊胚率為2.27％; DMEM試驗組成熟率為47.50％，卵裂率為20.50％和囊胚率為2.43％。比較結

4、果發(fā)現(xiàn)TCM199試驗組與對照組無顯著差異，進而將TCM199試驗組的胚胎進行胚胎移植，母豬受孕后產下11頭小豬，小豬健康狀況良好，體貌特征與自然受孕分娩的小豬無差異，所以TCM199（含HEPE）可以作為豬卵母細胞體外延遲保存液。為完善體外延遲保存體系，確立更好的延遲保存條件，設計將卵母細胞放入TCM199（含HEPE）后分別在4℃、25℃和37℃中保存6-8h后轉入成熟培養(yǎng)液，統(tǒng)計分析各試驗組之間成熟率，卵裂率和囊胚率的差別。其中4

5、℃試驗組成熟率為19.00％，卵裂率為9.5％和無囊胚;25℃試驗組成熟率為33.00％，卵裂率為15.00％和無囊胚;37℃試驗組成熟率為76.50％，卵裂率為54.50％和囊胚率為13.76％。比較結果得出37℃為理想的體外延遲保存溫度。這一研究為實現(xiàn)卵母細胞發(fā)育初始時間的可控性提高可能。
　　第二方面，為實現(xiàn)單精注射技術與BAC載體技術相結合制備轉基因豬胚胎的目標。需要利用ICSI技術成功制備出豬胚胎。首先將精子以工作3s，