利用胞漿內(nèi)單精子注射技術生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊的研究.pdf

1、為了建立高效穩(wěn)定的動物轉(zhuǎn)基因技術平臺，本論文探索了卵胞漿內(nèi)單精子注射法(IntracytoplasmicSpermInjection，ICSI)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊的可行性。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：1.首先，利用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡對綿羊凍融精子與DNA的結(jié)合情況進行了觀察和確認。實驗表明，綿羊凍融精子可以有效的結(jié)合外源DNA。 2.比較了Piezo注射法與常規(guī)注射法對ICSI轉(zhuǎn)基因效率的影響。實驗結(jié)果顯示，Piezo注射法IC

2、SI胚胎的陽性率平均達到79.1％，而常規(guī)注射法ICSI胚胎的陽性率僅為9.0％。 3.探討了兩種不同的激活方法對ICSI卵子發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，離子霉素(Ionomycin)與放線菌酮(CHX)聯(lián)合激活組ICSI卵子的卵裂率高于離子霉素(Ionomycin)單獨處理組(85.1％vs59.8％，P＜0.01)。 4.比較了三種不同濃度DNA對ICSI轉(zhuǎn)基因效率的影響。結(jié)果表明，5ng/μL的質(zhì)粒pEGFP-N1與綿羊

3、凍融精子共孵育后，ICSI轉(zhuǎn)基因的效率最佳，卵裂率、囊胚率和胚胎陽性率分別達到84.7％、8.8％和87.3％。 經(jīng)過如上體系的確立，使用Piezo裝置對綿羊體外成熟的卵母細胞實施單精注射，獲得平均為85.1％的卵裂率，7.6％的囊胚率，胚胎陽性率平均達到了79.1％。將135枚綿羊單精注射胚胎(包括85枚早期胚胎、35枚桑椹胚利15枚囊胚)移植到24只同期發(fā)情的小尾寒羊受體。其中有1只受體在胚胎移植后第129天確定為懷孕，并在