單純皰疹病毒Ⅰ型體外感染人口腔上皮細(xì)胞的初步探討.pdf

1、牙周病是人類常見病之一，是成人牙齒喪失的主要原因。牙周炎的發(fā)病機(jī)制一直是近年來牙周病學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。眾所周知，牙菌斑為牙周病的始動(dòng)因子，它與牙石，食物嵌塞，驗(yàn)創(chuàng)傷等局部因素和全身因素共同作用引起牙周病。但細(xì)菌致病學(xué)說并不能很好地解釋牙周病的部位特異性以及間斷爆發(fā)性等問題。同時(shí)基因檢測等分子生物學(xué)技術(shù)問世和不斷發(fā)展，許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在牙周炎患者病變位點(diǎn)的齦溝液和牙齦組織中常可檢測到皰疹病毒，尤其是單純皰疹病毒I型。因此提出單純皰疹病毒感

2、染與各型牙周炎具有一定相關(guān)關(guān)系.單純皰疹病毒在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中又是通過怎樣的途徑發(fā)揮作用的?？紤]到病毒感染宿主的第一步便是病毒吸附進(jìn)入宿主細(xì)胞，而人口腔上皮細(xì)胞又是人類口腔中先天性防御系統(tǒng)的第一道屏障，因此在體外建立一個(gè)單純皰疹病毒Ⅰ型感染人口腔上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途途哂衅涮厥獾囊馑肌１狙芯繑M在體外大量擴(kuò)增獲得HSV-1，再用標(biāo)化的病毒直接感染人口腔上皮細(xì)胞KB細(xì)胞系，建立HSV-1體外感染人口腔上皮細(xì)胞模型。并通過間接感染的方法“轉(zhuǎn)移

3、感染”Vero細(xì)胞，利用倒置顯微鏡、透射電鏡技術(shù)和PCR技術(shù)對(duì)模型建立結(jié)果進(jìn)行鑒定. 實(shí)驗(yàn)一 HSV-1體外感染人口腔上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒛康脑隗w外建立HSV-1感染人口腔上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并運(yùn)用一定方法進(jìn)行鑒定。 材料和方法在體外利用Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)擴(kuò)增HSV-1，并利用噬斑計(jì)數(shù)法測定病毒滴度(PFU/ml)，用此病毒分別以MOI為0.5PFU/cell、1.0 PFU/cell、3.0 PFU/cel

4、l感染人口腔上皮細(xì)胞KB細(xì)胞，并以正常Vero細(xì)胞上清液代替HSV-1病毒液作為空白對(duì)照。分別于0h、24h、48h在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，于感染后48h收集細(xì)胞，制成超薄切片在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。并用PCR技術(shù)檢測感染后KB細(xì)胞基因組中是否包含HSV-1特異性的糖蛋白D基因片段。 結(jié)果：在體外通過Vero細(xì)胞成功的擴(kuò)增出大量HSV-1，并將其滴定標(biāo)化為106PFU/ml。HSV-1體外感染KB細(xì)胞后于24h，48h

5、在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，未觀察到明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)。透射電鏡下，KB細(xì)胞核內(nèi)及胞漿內(nèi)均未見HSV-1病毒顆粒。而KB細(xì)胞基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳后可見一位于709 bp位置的陽性條帶，與預(yù)測結(jié)果一致。 結(jié)論：HSV-1體外感染人口腔上皮KB細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?。KB細(xì)胞為HSV-1的非允許性細(xì)胞，HSV-1感染KB細(xì)胞后可能形成轉(zhuǎn)化性感染或潛伏性感染。 實(shí)驗(yàn)二KB細(xì)胞的上清液對(duì)Vero細(xì)胞的“轉(zhuǎn)移感染”及鑒定目

6、的通過“轉(zhuǎn)移感染”的間接方法將前述實(shí)驗(yàn)中KB細(xì)胞的上清液感染對(duì)HSV-1敏感的Vero細(xì)胞，以此檢驗(yàn)HSV-1是否成功感染人口腔上皮KB細(xì)胞。 材料和方法收集實(shí)驗(yàn)一模型中不同MOI組HSV-1體外感染KB細(xì)胞48h后的培養(yǎng)上清，并以之感染HSV-1的允許性細(xì)胞Vero細(xì)胞。分別于0h、24h、48h在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，于感染后48h收集細(xì)胞，制成超薄切片在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)和病毒形態(tài)。并在“轉(zhuǎn)移感染”48h后計(jì)算

7、細(xì)胞病變率。 結(jié)果：倒置顯微鏡下，Vero細(xì)胞“轉(zhuǎn)移感染”24h時(shí)可觀察到細(xì)胞病變出現(xiàn)；48h時(shí)細(xì)胞病變率上升。掃描電鏡下Vero細(xì)胞核內(nèi)可見大量大小均一的典型HSV-1顆粒。通過對(duì)細(xì)胞病變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得知各滴度組“轉(zhuǎn)移感染”后Vero細(xì)胞病變率有顯著性差異。 結(jié)論： KB細(xì)胞中潛伏的病毒被活化并在Vero細(xì)胞中產(chǎn)生了感染性病毒顆粒，證明了HsV-1可在體外感染口腔上皮細(xì)胞，并表達(dá)其基因。 綜上所述，本研究利用v