模式識(shí)別受體激動(dòng)劑poly(I-C)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及逆轉(zhuǎn)免疫耐受作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　 根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，胃癌已經(jīng)成為世界上第二常見的惡性腫瘤，尤其是在亞洲地區(qū)，嚴(yán)重危脅著人類健康。相比手術(shù)、放療及化療等傳統(tǒng)的治療方法，生物治療被認(rèn)為是一種有潛力的治療方法。但是由于技術(shù)、費(fèi)用等的限制，生物治療在臨床上應(yīng)用仍有一定的困難。因此急需新的生物治療手段和藥物的研發(fā)，為胃癌的預(yù)防與治療提供新的策略。
　　 越來越多的研究證實(shí)，模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptors，PRR

2、s)不僅表達(dá)在免疫細(xì)胞中，在各種實(shí)質(zhì)細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞中也有廣泛的表達(dá)，且表達(dá)譜各異，這就提示在非免疫細(xì)胞中PRR活化傳遞了不同于內(nèi)源性免疫激活過程的分子事件。有關(guān)研究提示，這些PRR在腫瘤發(fā)生中的作用可能是把雙刃劍，即在不同的腫瘤細(xì)胞和組織中，不同的PRR的激活可以產(chǎn)生完全不同的生物學(xué)效果，有的可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存，有的則明顯抑制腫瘤細(xì)胞存活。
　　 TLR3在細(xì)胞膜和內(nèi)吞溶酶體均有表達(dá)，可識(shí)別dsRNA以及其類似物多聚次黃嘌

3、呤多聚胞嘧啶核苷酸poly(I:C)，產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)。同時(shí)，表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)的胞漿RNA受體RLR也可以識(shí)別dsRNA和poly(I:C)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。Poly(I:C)在腫瘤免疫治療中的作用已被廣泛論證。Poly(I:C)不僅能夠作為免疫佐劑用于臨床治療，而且還可以直接誘導(dǎo)多種腫瘤的凋亡。然而，在胃癌細(xì)胞中，通過不同方式輸送poly(I:C)對(duì)癌癥發(fā)展進(jìn)程的影響仍不清楚。本研究通過探索poly(I:C)對(duì)胃癌細(xì)胞的腫瘤行為影響，

4、有助于了解激活腫瘤細(xì)胞PRR后的腫瘤生物學(xué)行為的更多分子細(xì)節(jié)，評(píng)價(jià)poly(I:C)用于胃癌生物治療的可行性，為設(shè)計(jì)和利用基于PRR的抗腫瘤治療藥物提供有益的啟示。
　　 研究方法:
　　 首先，以胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和BGC-823細(xì)胞為模型，采用半定量RT-PCR檢測(cè)TLR1-TLR10mRNA基礎(chǔ)表達(dá)水平;MTT法、CCK-8法、EdU摻入法檢測(cè)poly(I:C)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖能力的影響;MTT法、CFSE-7-A

5、AD法評(píng)價(jià)NK細(xì)胞對(duì)poly(I:C)處理后的胃癌細(xì)胞殺傷能力的影響;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA水平的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLR3、CyclinD1、MICA/B、ULBP2、CD54、Fas表達(dá)水平以及NKL細(xì)胞中CD107a、Perforin和TNF-α的分泌水平。
　　 然后，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將poly(I:C)轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞內(nèi)，AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;實(shí)時(shí)定量PC

6、R法檢測(cè)RLRs、Ⅰ型干擾素通路關(guān)鍵基因以及炎癥因子的表達(dá)水平;siRNA分別沉默三種RLR受體;Western-blot檢測(cè)NF-κB的活化;用干擾素受體阻斷實(shí)驗(yàn)和外加干擾素實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ⅰ型干擾素在poly(I:C)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用;分別用實(shí)時(shí)定量PCR和FACS檢測(cè)凋亡相關(guān)分子Bcl-2家族基因mRNA和蛋白水平改變;構(gòu)建pLMP-anti-Drosha質(zhì)粒，檢測(cè)沉默microRNA后，poly(I:C)對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。通過建立

7、BGC-823裸鼠腫瘤異種移植模型，觀察poly(I:C)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　 最后，轉(zhuǎn)染poly(I:C)后，MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷能力以及流式細(xì)胞術(shù)分析胃癌細(xì)胞表面殺傷相關(guān)配體的表達(dá)水平。同時(shí)，用轉(zhuǎn)染poly(I:C)后的腫瘤細(xì)胞上清孵育NK細(xì)胞，MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞的增殖、殺傷能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力，流式細(xì)胞術(shù)分析脫顆粒能力、殺傷相關(guān)受體表達(dá)水平、以及促炎因子的分泌情況。
　　

8、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 (1)胞外poly(I:C)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，這一過程的主要分子特征是DNA合成能力減弱、CyclinD1的表達(dá)水平降低，炎癥因子mRNA的表達(dá)水平下降;同時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)于poly(I:C)處理后的胃癌細(xì)胞的殺傷功能增強(qiáng)，NK細(xì)胞分泌CD107a、perforin、TNF-α的能力提高。
　　 (2)轉(zhuǎn)染poly(I:C)后，體外觀察到了明顯的促胃癌細(xì)胞凋亡作用，且體內(nèi)可以有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

9、這種促凋亡作用依賴于RLR的活化，但是不依賴于TLR3和PKR，并且Ⅰ型干擾素不參與直接的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族也許在促凋亡過程中起作用。
　　 (3)Poly(I:C)處理后的胃癌細(xì)胞對(duì)于NK細(xì)胞的殺傷敏感性增強(qiáng)，同時(shí)伴隨著NK細(xì)胞活化性受體NKG2D配體MICA/B和Fas的表達(dá)上調(diào)，NKG2A抑制性配體HLA-ABC的表達(dá)下調(diào)。對(duì)poly(I:C)處理后的胃癌細(xì)胞上清孵育NK細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞的增殖

10、、遷移以及殺傷能力均有所增強(qiáng)，同時(shí)活化性受體及殺傷相關(guān)分子表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NK細(xì)胞的活化依賴于poly(I:C)刺激后胃癌細(xì)胞產(chǎn)生的大量Ⅰ型干擾素。
　　 結(jié)論及意義:
　　 胞外poly(I:C)可直接抑制腫瘤的生長(zhǎng)并提高胃癌細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性;胞內(nèi)poly(I:C)不僅具有直接的促凋亡作用，而且可以通過改善腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)天然免疫應(yīng)答，逆轉(zhuǎn)機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)。免疫刺激性RNA分子的合理應(yīng)用，著眼于調(diào)動(dòng)