樹突細(xì)胞及其模式識別受體與變應(yīng)性鼻炎關(guān)系的研究.pdf

1、第一部分:樹突細(xì)胞成熟與小鼠變應(yīng)性鼻炎關(guān)系的研究
　　 目的:利用卵清蛋白建立變應(yīng)性鼻炎小鼠動(dòng)物模型,探討樹突細(xì)胞成熟與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系。
　　 方法:選用BALB/C小鼠,采用OVA腹腔注射方法致敏小鼠,以1％OVA激發(fā)建立小鼠模型。HE染色觀察鼻粘膜局部嗜酸性粒細(xì)胞等的浸潤情況,以免疫熒光法檢測小鼠鼻粘膜DEC205、CD86表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:全身致敏組均出現(xiàn)明顯連續(xù)抓鼻及持續(xù)噴嚏癥狀,全身致敏組均出現(xiàn)

2、鼻粘膜局部嗜酸性粒細(xì)胞增多；免疫熒光結(jié)果顯示小鼠樹突細(xì)胞相對特異的表面標(biāo)志DEC-205及成熟DC標(biāo)志CD86在變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻粘膜表達(dá)顯著增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:OVA可以成功誘發(fā)小鼠變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生,樹突細(xì)胞參與OVA誘發(fā)小鼠變應(yīng)性鼻炎的過程,樹突細(xì)胞在鼻粘膜局部的增多和成熟可能對變應(yīng)性鼻炎發(fā)生起重要作用。
　　 第二部分:變應(yīng)原對樹突細(xì)胞TOLL樣受體表達(dá)的影響
　　 目的:探討OVA抗原刺激劑量與樹突細(xì)胞成熟

3、的關(guān)系。研究OVA抗原刺激對樹突細(xì)胞模式識別受體TLR1～9(Toll-like receptorl～9)表達(dá)的影響,篩選可能在樹突細(xì)胞遞呈OVA抗原過程中起主要作用的TLR。
　　 方法:取BALB/C小鼠骨髓細(xì)胞,利用GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng),觀察樹突細(xì)胞的形態(tài),FACS檢測樹突細(xì)胞表面標(biāo)志CD11C、CD80、CD86、MHC-Ⅱ,并觀察OVA劑量與樹突細(xì)胞成熟的關(guān)系；DC培養(yǎng)第7天分別加入10μg/ml、100μg

4、/ml、1000μg/ml OVA溶液至6孔板,刺激24小時(shí)后收集各組細(xì)胞,制備RNA樣品,RT-PCR檢測TLR1～9的表達(dá)。根據(jù)RT-PCR結(jié)果利用Western blot檢測相關(guān)的TLR的蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:培養(yǎng)的樹突細(xì)胞從第四天開始出現(xiàn)小的毛刺狀突起,呈懸浮或半貼壁集簇狀生長,隨著時(shí)間延長,懸浮細(xì)胞逐漸增多。OVA刺激24小時(shí)之后,共刺激分子CD80和CD86以及MHC-Ⅱ表達(dá)均增加,且隨著OVA刺激劑量的增加而

5、表達(dá)逐漸增強(qiáng),提示樹突細(xì)胞隨OVA刺激劑量的增加而愈趨向成熟。按照control組、10μg/ml組、100μg/ml組、1000μg/ml組順序,FACS檢測結(jié)果:CD11C為77.47±2.47％、80.53±2.74％、80.30±0.70％、79.31±2.10％；CD80為46.57±0.59、77.37±0.64％、82.27±1.19％、91.50±0.75％；CD86為7.43±0.67％、47.30±2.07％、66.

6、37±1.32％、89.93±1.05％:MHC-Ⅱ?yàn)?5.57±0.61％、82.27±0.35％、85.63±1.03％、95.57±0.59％。RT-PCR檢測到小鼠骨髓來源樹突細(xì)胞表達(dá)TLR1～9,TLR2、3、4的表達(dá)明顯,且隨著OVA刺激劑量增加,TLR2的表達(dá)出現(xiàn)明顯增強(qiáng),而TLR1、3、4、5、6、9的表達(dá)各組間無顯著差異。TLR7、8表達(dá)在10μg/ml組出現(xiàn)明顯增強(qiáng),隨著OVA劑量增加,表達(dá)反而降低。Western

7、blot檢測結(jié)果同樣顯示TLR2表達(dá)隨OVA劑量增加而增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 通過GM-CSF和IL-4的聯(lián)合作用,結(jié)合合理的培養(yǎng)方法,可獲得足量的、純度較高的樹突細(xì)胞；
　　 在體外試驗(yàn)中,樹突細(xì)胞可以直接識別捕獲OVA,在OVA刺激下逐漸成熟,成熟的DC其共刺激分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表達(dá)增高,具有了刺激T淋巴細(xì)胞增值分化的能力。
　　 OVA上調(diào)DC TLR2的表達(dá)。TLR2信號途徑

8、可能參與了OVA誘導(dǎo)樹突細(xì)胞成熟及抗原遞呈過程。
　　 第三部分:TLR2和MR RNAi對小鼠樹突細(xì)胞抗原內(nèi)吞作用和樹突細(xì)胞成熟的影響
　　 目的:通過調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞抗原內(nèi)吞或遞呈相關(guān)的MR和TLR2的表達(dá),觀察其對樹突細(xì)胞活化成熟及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響,分析兩者在DC抗原遞呈中的可能作用,探討DC表面介導(dǎo)糖蛋白類變應(yīng)原識別及內(nèi)吞的可能受體。
　　 方法:利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將T

9、LR2 SiRNA序列和MRSiRNA序列轉(zhuǎn)染進(jìn)樹突細(xì)胞,RT-PCR檢測RNA干擾的效果。利用FITC-OVA觀察樹突細(xì)胞內(nèi)吞OVA的情況,并同時(shí)行FACS檢測樹突細(xì)胞內(nèi)吞。FITC-OVA的程度；通過FACS檢測CD86表達(dá)來觀察TLR2 RNAi和MR RNAi對小鼠樹突細(xì)胞接受OVA及塵螨等糖蛋白類變應(yīng)原刺激后成熟狀態(tài)的影響。
　　 結(jié)果:利用NC-FAM轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率為87.5％以上。通過RN

10、Ai成功抑制樹突細(xì)胞TLR2和MR的表達(dá)。MR RNAi可以明顯抑制樹突細(xì)胞對FITC-OVA內(nèi)吞作用,限制樹突細(xì)胞的成熟。TLR2 RNAi盡管可以抑制TLR2表達(dá)達(dá)50％以上,然而對樹突細(xì)胞內(nèi)吞變應(yīng)原的作用無明顯影響。特別是MR RNAi同樣可以抑制屋塵螨粉塵滿混合變應(yīng)原誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞成熟過程。OVA刺激后樹突細(xì)胞分泌IL-10增多,分泌IL-12減少,而RNAi抑制小鼠樹突細(xì)胞TLR2和MR的表達(dá)可以抑制OVA刺激引起的樹突細(xì)胞I

11、L—10和IL-12的這種變化趨勢,即抑制DC細(xì)胞因子IL—10的分泌,并上調(diào)IL-12水平。
　　 結(jié)論:
　　 抑制MR的表達(dá),可以抑制樹突細(xì)胞對OVA抗原的內(nèi)吞作用；
　　 下調(diào)MR表達(dá),可以抑制OVA及塵螨誘導(dǎo)的DC成熟；
　　 TLR2 RNAi不影響DC對OVA的內(nèi)吞,但可抑制DC細(xì)胞因子IL-10的分泌,并上調(diào)IL-12水平。；
　　 MR可能是介導(dǎo)DC對環(huán)境變應(yīng)原識別及內(nèi)吞的關(guān)鍵模