CUEDC2在熱休克反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的功能及機制研究.pdf

1、本項工作主要研究CUE domain containing2(CUEDC2)蛋白質(zhì)在熱休克反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用,發(fā)現(xiàn)CUEDC2蛋白質(zhì)參與到上述兩條通路中,發(fā)揮了重要的的功能。CUEDC2是一個含有CUE結(jié)構(gòu)域的基因,對它的功能研究比較少。CUE結(jié)構(gòu)域為一個大約含有40個氨基酸的序列,存在于許多的真核細胞蛋白質(zhì)中,如Tollip、TAB2、TAB3、VPS9等。含有CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)廣泛參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮重要的功

2、能。我們前期工作發(fā)現(xiàn)CUEDC2能夠與孕激素受體progesterone receptor(PR)發(fā)生相互作用,促進孕激素依賴的孕激素受體發(fā)生泛素化并且降解,從而提示CUEDC2可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展(The EMBO Journal,2007)。進一步研究還發(fā)現(xiàn),CUEDC2能夠與IKKalpha、IKKbeta發(fā)生相互作用,并且通過招募 growth arrest and DNA-damage-inducible34(GADD3

3、4)和protein phosphatase1(PP1)使IKK復(fù)合體發(fā)生去磷酸化,抑制NF-κB信號通路(Nature Immunology,2008)。以上對CUEDC2的研究提示CUEDC2可能參與不同的信號通路,并發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。本項工作主要探討 CUEDC2在熱休克反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用及其機制。
　　為了進一步研究CUEDC2的功能,我們運用親和純化結(jié)合質(zhì)譜的方法,鑒定了CUEDC2與heat sho

4、ck70kDa protein(HSP70)和heat shock cognate70kDa protein(HSC70)存在相互作用。已知HSP70與HSC70具有較高的保守性,而且研究發(fā)現(xiàn)HSP70參與了眾多的細胞內(nèi)反應(yīng)過程,具有更為廣泛的功能,因此,本研究著重探討CUEDC2與HSP70之間相互作用的意義。我們首先通過免疫共沉淀實驗驗證了這一相互作用,并且證明了CUEDC2與HSP70存在熱休克反應(yīng)依賴的內(nèi)源相互作用。免疫熒光實驗

5、證實了CUEDC2與HSP70具有細胞內(nèi)共定位,并且在熱激后,這種共定位有所增強。進一步研究證實,CUEDC2的CUE結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了這兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用,HSP70通過其peptide binding domain(PBD)結(jié)構(gòu)域和carboxyl-terminal sequence(CT)區(qū)域與CUEDC2發(fā)生相互作用。HSP70包含三個確定的結(jié)構(gòu)域,分別是ATP酶結(jié)構(gòu)域,肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端的一段保守序列。ATP酶結(jié)構(gòu)域參與AT

6、P的水解,與HSP70的伴侶功能相關(guān);肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域是HSP70與底物的結(jié)合區(qū),HSP70的許多底物如AIF, JNK等均與此區(qū)域結(jié)合;HSP70的C末端包含Glu-Glu-Val-Asp四個非常保守的氨基酸,這一區(qū)域?qū)τ贖SP70的許多共伴侶如HSP40、HOP、CHIP結(jié)合HSP70十分重要,這些共伴侶通過與HSP70的C末端結(jié)合調(diào)節(jié)HSP70的伴侶功能。由于本項研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2結(jié)合的是HSP70的PBD和C末端區(qū)域,因此我們推測

7、,CUEDC2可能能夠調(diào)控HSP70的伴侶功能。我們通過細胞內(nèi)的熒光素酶重折疊實驗發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)過表達CUEDC2能夠抑制HSP70介導(dǎo)的伴侶功能,缺失HSP70結(jié)合區(qū)域的CUEDC2突變體對HSP70的伴侶功能沒有明顯影響,說明CUEDC2能夠調(diào)控HSP70的伴侶功能。而HSP70的一些共伴侶,如CHIP、Hip等,除了調(diào)節(jié)HSP70的伴侶功能外,還能夠參與熱休克反應(yīng)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了檢測CUEDC2是否參與了熱休克反應(yīng),我們分別對穩(wěn)定和

8、瞬時干涉CUEDC2的細胞進行了熱激,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干涉CUEDC2的表達能夠抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP70的表達。由于熱激過程中熱休克蛋白質(zhì)的表達受到轉(zhuǎn)錄因子 Heat shock transcription factor1(HSF1)的調(diào)控,通過雙熒光報告系統(tǒng)測活實驗發(fā)現(xiàn),干涉CUEDC2能夠明顯抑制熱激誘導(dǎo)的HSF1的轉(zhuǎn)錄活性,而過表達CUEDC2能夠促進熱激誘導(dǎo)的HSF1的轉(zhuǎn)錄活性。免疫共沉淀實驗證實在熱激之后,CUEDC2能夠與HSF

9、1結(jié)合,提示CUEDC2影響HSF1轉(zhuǎn)錄活性可能與這兩者結(jié)合有關(guān)。以上研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2能夠通過與HSP70結(jié)合,參與調(diào)節(jié)HSP70的伴侶活性,并且通過與HSF1結(jié)合調(diào)節(jié)了熱應(yīng)激反應(yīng)中熱休克蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達,從而揭示了一個新的熱休克反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì),也為CUEDC2的功能研究提供了新的線索。
　　缺氧、氧化應(yīng)激、高脂肪飲食、低血糖、病毒感染等多種刺激和一些病理情況均能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白質(zhì)的聚集,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。近年來研究發(fā)

10、現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與眾多人類疾病相關(guān),如神經(jīng)退行性疾病、雙向性精神障礙、腫瘤、中風(fēng)、缺血再灌注損傷、心臟疾病、糖尿病等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)激活的細胞內(nèi)主要信號通路是未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)。UPR主要包括三條通路,即IRE1α-ASK1-JNK(IRE1α-XBP1), PERK-EIF2α以及ATF6通路。前期工作中我們發(fā)現(xiàn) CUEDC2可能參與對 JNK通路的調(diào)控,基于此線索,我們研究了CUEDC2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用。首先我們運

11、用高滲透壓應(yīng)激等不同種刺激處理細胞,發(fā)現(xiàn)在干涉CUEDC2的細胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的JNK活性降低。之后我們通過不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑,以及在穩(wěn)定干涉和瞬時干涉的細胞中都驗證了這一結(jié)果。而干涉CUEDC2對于高滲透壓激活的JNK通路沒有影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的JNK激活是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的IRE1α招募 TRAF2、ASK1介導(dǎo)的。我們首先考慮CUEDC2影響JNK激活的作用位點應(yīng)該不會在MAPKK(MKK4, MKK7)和JNK水平,因為已

12、知不同種刺激幾乎都是通過 MKK4和MKK7激活JNK,如果CUEDC2影響的是MAPKK和JNK,那么多種刺激激活的JNK都應(yīng)該受到影響,這與我們的實驗結(jié)果不符。另外,也未發(fā)現(xiàn)CUEDC2與JNK存在相互作用(論文第一部分結(jié)果)。因此,CUEDC2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中最有可能影響的蛋白質(zhì)是TRAF2、IRE1α和ASK1。通過免疫共沉淀實驗我們發(fā)現(xiàn) CUEDC2能夠與 ASK1發(fā)生相互作用,而與另一MAPKKK水平激酶MEKK1之間不存

13、在相互作用。之后證明了CUEDC2與ASK1之間的相互作用是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激依賴的。免疫共沉淀實驗證實CUEDC2的C末端(133-287)介導(dǎo)了CUEDC2與ASK1的相互作用,而ASK1的C端介導(dǎo)了這兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活 IRE1α-ASK1-JNK信號通路的一個重要結(jié)果是細胞死亡,這一點在神經(jīng)退行性疾病和心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。另外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的JNK激活在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色

14、。我們之后的研究將著重探索 CUEDC2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞死亡以及胰島素受體耐受過程中發(fā)揮的作用。以上研究證實在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時 CUEDC2通過與ASK1結(jié)合調(diào)節(jié)JNK的激活,并且確定了CUEDC2與ASK1相互作用的區(qū)域。在今后的研究中,我們將進一步研究這一現(xiàn)象的生物學(xué)意義以及在疾病中可能發(fā)揮的功能。
　　以上兩部分工作由于涉及CUEDC2參與不同的信號通路及其相對獨立的功能,因此分為兩部分展示。當(dāng)然,CUEDC2這兩種不同的