內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠煤工塵肺引發(fā)認(rèn)知功能改變中的作用.pdf

1、研究背景及目的:煤工塵肺(Coal worker's pneumocomosis,CWP)是我國我省重要的職業(yè)病之一,由于其導(dǎo)致的嚴(yán)重呼吸功能障礙可對腦功能產(chǎn)生不利影響,已日益受到社會的重視。研究探討煤工塵肺對腦功能影響的原因和機(jī)制,有重要的臨床價值,也是我們醫(yī)學(xué)界義不容辭的責(zé)任。研究顯示,隨著煤工塵肺的晉級,肺功能正常率降低,肺功能障礙的危險性第次增加,常常引起與肺臟損害不成比例的更加嚴(yán)重的肺功能障礙,而持續(xù)的低氧血癥和高碳酸血癥,將

2、引起呼吸系統(tǒng)以外多器官系統(tǒng)的損傷,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響尤為明顯,早期即可引起學(xué)習(xí)力、記憶力、計算力等認(rèn)知功能的改變,但其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成、修飾、裝配折疊以及Ca2+儲存的重要細(xì)胞器,近年來,其在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、影響細(xì)胞存亡的作用業(yè)已日益引起廣大學(xué)者的高度重視。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂,如葡萄糖缺乏、Ca2+穩(wěn)態(tài)改變、自由基損傷等導(dǎo)致蛋

3、白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和積聚從而引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致特異性的細(xì)胞凋亡,被認(rèn)為是繼死亡受體和線粒體途徑之后的第三條細(xì)胞凋亡途徑。誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的理化因素包括缺血、低氧、氧化應(yīng)激、紫外線、營養(yǎng)物質(zhì)不足、病毒、毒性物質(zhì)、高同型半胱氨酸血癥等,這些因素可以分別通過不同機(jī)制引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激一方面可以通過各種途徑使細(xì)胞蛋白質(zhì)合成水平下降、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)上調(diào),提

4、高細(xì)胞對各種刺激的抵抗能力,幫助細(xì)胞盡快恢復(fù)穩(wěn)態(tài);另一方面,當(dāng)刺激因素持續(xù)存在或強(qiáng)度過大,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)性反應(yīng)不足以恢復(fù)細(xì)胞常態(tài)時,將啟動程序性細(xì)胞凋亡途徑,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 煤工塵肺形成后導(dǎo)致的長期、慢性缺氧,是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激發(fā)因素。通過激活神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),,繼而激活經(jīng)由以caspase-12為起始因子和以CHOP信息分子為中心的細(xì)胞凋亡途徑,導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,很可能是引起腦功能障礙的重要機(jī)制。
　

5、　 我們導(dǎo)師牛小媛教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊,在煤工塵肺與腦功能改變領(lǐng)域做了有意義的探索,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)煤工塵肺患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)病率較高,并進(jìn)行了系列的動物實驗研究。本項研究以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激理論為指導(dǎo),通過成功復(fù)制煤工塵肺引發(fā)認(rèn)知功能障礙的大鼠模型,探討煤工塵肺對認(rèn)知功能影響的發(fā)病機(jī)制,為臨床診斷和治療提供新思路和新策略。本項研究共分兩部分:第一部分,主要建立大鼠煤工塵肺以及對學(xué)習(xí)記憶功能影響的動物模型;第二部分,重點探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在煤工塵肺大鼠認(rèn)

6、知功能障礙發(fā)病中的作用。
　　 第一部分煤工塵肺對學(xué)習(xí)記憶功能影響的動物模型的建立
　　 研究方法:雄性Wistar大鼠100只,體重180～200g。取晉城市礦務(wù)局一級無煙煤研磨粉碎,200目鋼網(wǎng)過濾、水選,用生理鹽水配成50g/L的懸液,高壓滅菌后備用。選擇18號靜脈套管針制備氣管導(dǎo)管。捕捉大鼠,腹部消毒,用10％水合氯醛(300mg/kg.w)經(jīng)腹腔麻醉后仰臥固定,直接經(jīng)口氣管插管,確定導(dǎo)管在氣管內(nèi)后,模型組動物灌

7、入煤塵生理鹽水懸液（1ml/只大鼠）,正常對照組動物灌入等量生理鹽水。實驗初始時灌注1次。全部實驗動物在同等條件下飼養(yǎng)并自由飲食。分別在實驗8周末和20周末,隨機(jī)各抽取實驗組與對照組大鼠20只,應(yīng)用Morris水迷宮系統(tǒng)分別測定其學(xué)習(xí)和記憶能力。隨后無菌操作,抽取腹主動脈血進(jìn)行血氣分析,摘取肺組織和腦組織,用于形態(tài)學(xué)觀察。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、Morris水迷宮定位航行試驗和空間探索試驗結(jié)果表明,模型組大鼠的學(xué)習(xí)

8、能力和記憶能力明顯受損,并與染塵時間相關(guān)。
　　 2、經(jīng)氣道灌注煤塵動物隨著染塵時間延長,動脈血氧分壓(PaO2)逐漸降低,PaCO2逐漸升高,說明實驗組動物染塵后肺功能逐漸降低,并且與染塵時間有關(guān)。
　　 3、肺組織膠原纖維(VanGieson,VG)染色結(jié)果表明,肺組織纖維化指數(shù)隨病程進(jìn)展顯示出明顯增高性變化,說明染塵是引起肺組織發(fā)生纖維化的重要因素。
　　 4、肺組織病理形態(tài)學(xué)變化:光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),染

9、塵8周可見肺組織中有大量煤塵沉積,間質(zhì)和肺泡區(qū)炎性反應(yīng),肺間質(zhì)出血,部分肺泡腔中有均勻的蛋白水腫液,肺組織有破壞,間質(zhì)纖維組織增生,部分區(qū)域可見代償性肺氣腫;
　　 染塵20周大鼠仍有大量煤塵沉積,可見吞噬了煤塵的巨大體積的巨噬細(xì)胞,水腫,病變區(qū)域肺泡壁增厚,間質(zhì)纖維組織增生明顯;代償性肺氣腫區(qū)域肺泡壁破壞,或者明顯被擠壓:可見多個煤塵結(jié)節(jié)。
　　 5、腦組織病理形態(tài)學(xué)變化:光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),8周時間點炎性反應(yīng)明顯,

10、總體表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、充血,膠質(zhì)細(xì)胞增多,間質(zhì)疏松、神經(jīng)細(xì)胞突起和核仁消失,提示腦組織有水腫和神經(jīng)細(xì)胞變性;部分神經(jīng)元核染色質(zhì)濃縮,可見少量凋亡小體。
　　 周時間點可見神經(jīng)細(xì)胞變性加重,核膜增厚,染色質(zhì)凝集成塊狀,核固縮更加明顯,凋亡小體較8周時間點增多;間質(zhì)有篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),提示有局灶性液化性壞死,可見核碎裂和壞死細(xì)胞。
　　 6、腦組織神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)染色計數(shù)表

11、明,NSE高特異性的定位于神經(jīng)元,煤工塵肺組的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯減少,提示了其導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制。
　　 第二部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在煤工塵肺大鼠認(rèn)知功能障礙發(fā)病中的作用
　　 研究方法:雄性Wistar大鼠,體重180～200g,山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,模型組經(jīng)氣管灌入煤塵生理鹽水懸液'(50g/L)Iml/只,對照組灌入生理鹽水1ml/只。實驗初始時灌注1次。全部實驗動物在同等條件下飼養(yǎng)并自

12、由飲食。染塵后8周末,動物經(jīng)10％水合氯醛(300mg/kg'w)腹腔注射麻醉,將腦組織取出,部分組織液氮凍存,制作勻漿,采用生物化學(xué)法檢測丙二醛(MDA)含量;部分組織于10％的中性甲醛固定,用于組織學(xué)研究。采用免疫組織化學(xué)染色方法,觀察HIF-1α、GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2的蛋白表達(dá),在光學(xué)顯微鏡下,使用B12000顯微圖像分析系統(tǒng)對陽性染色面積進(jìn)行半定量分析;采用TUNEL法,進(jìn)行凋亡細(xì)胞染色,同樣使

13、用B12000顯微圖像分析系統(tǒng)計數(shù)陽性染色細(xì)胞。
　　 研究結(jié)果:與正常對照組相比較,模型組MDA含量、HIF-1α、GRP78、CHOP、caspase-12、Bcl-2的蛋白表達(dá)量均明顯增加,凋亡細(xì)胞陽性率顯著升高。形態(tài)學(xué)也觀察到明顯增加的凋亡征象,充分說明煤工塵肺8周大鼠發(fā)生的低氧血癥,引發(fā)了腦組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),并引起了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　 綜合上述研究結(jié)果,本項研究的意義在于:(1)成功復(fù)制了煤工塵肺導(dǎo)致認(rèn)知