水牛FSHR基因與其表達(dá)檢測的研究.pdf

1、本論文研究內(nèi)容是水牛FSHR基因和表達(dá)檢測體系的建立。論文共分為兩部分：第一部分為文獻(xiàn)綜述部分；第二部分，包括第一章和第二章，為試驗(yàn)研究部分。 第一章研究目的是通過對水牛FSHR基因的克隆、序列分析，為進(jìn)一步研究FSHR基因的作用機(jī)理和設(shè)計(jì)特異于水牛FSHR基因的半定量檢測引物打下基礎(chǔ)。根據(jù)荷斯坦牛FSHR基因設(shè)計(jì)引物，分別以水牛血液DNA和卵巢組織總RNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

2、從水牛血液DNA和卵巢的mRNA中擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA和cDNA片段。該擴(kuò)增片段經(jīng)純化后，連接到pMD18-T載體上擴(kuò)增測序。測序后分析表明，該基因5’啟動子區(qū)(Promoter)長度為967 bp，cDNA全長2229bp，其中1～64 bp為5’側(cè)翼序列(UTR)，2153～2229 bp為3，側(cè)翼序列(UTR)，65～2152 bp為FSHR的讀碼框(ORF)，1457～2152 bp為FSHR的第10外顯子。BLAST比對顯示，與

3、牛屬動物的同源性為98％，與羊?qū)?7％，具有高度的進(jìn)化保守性。使用ClustalX對水牛FSHR基因外顯子區(qū)域做多重比對分析后，構(gòu)建部分哺乳動物系統(tǒng)進(jìn)化樹，與實(shí)際進(jìn)化關(guān)系保持很好的一致。使用TMHMM Server v.2.0對包括編碼FSHR678個氨基酸和N’端17個氨基酸信號肽的全部序列(起始密碼子為通用密碼子ATG，終止密碼子為TAA)進(jìn)行分析，該受體胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域三部分的大小分別為349、264和65個氨基酸。

4、 第二章是根據(jù)第一章中水牛FSHR基因前半段序列設(shè)計(jì)特異于水牛的鑒定引物，根據(jù)豬、水?；蛟O(shè)計(jì)內(nèi)參引物β-action，采用半定量檢測法比較和分析在不同組織、不同卵泡類型、不同質(zhì)量的COCs顆粒細(xì)胞上卵泡刺激素受體mRNA(FSHR mRNA)的表達(dá)差異，以及COCs培養(yǎng)過程中卵泡FSHR mRNA的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，1)在卵巢、睪丸中FSHR基因有表達(dá)，而其他檢測的組織中沒有表達(dá)；2)不同直徑大小卵泡之間的COCs顆粒細(xì)胞上FSHR

5、 m、RNA相對表達(dá)量有差異，大卵泡的COCs與中、小卵泡COCs之間差異顯著，中、小卵泡COCs之間無顯著差異，小卵泡的表達(dá)強(qiáng)于大卵泡；3)A、B、C三類COCs顆粒細(xì)胞上FSHR mRNA相對表達(dá)量有差異，A、B類COCs之間及B、C類COCs之間有顯著差異，A類COCs顯著高于C類COCs；4)在體外培養(yǎng)的0 h、6 h、12 h、18 h、24 h五個不同時段中，隨著培養(yǎng)時間的延長，COCs顆粒細(xì)胞上FSHR mRNA的相對表達(dá)