水牛顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和miRNA表達(dá)及雌二醇對(duì)其表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物卵泡在發(fā)育過(guò)程中,除少量發(fā)育成熟并排卵外,絕大部分發(fā)生退化、閉鎖。研究表明,卵泡閉鎖的主要誘因是顆粒細(xì)胞凋亡。目前已有人、鼠、牛、豬、綿羊和山羊等動(dòng)物的顆粒細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)理的研究報(bào)道,但對(duì)水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖的分子機(jī)制研究較少。為此,本試驗(yàn)首先對(duì)不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及miRNA的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了分析,以了解顆粒細(xì)胞凋亡與卵泡閉鎖的關(guān)系,初步闡明水牛卵泡閉鎖的分子機(jī)制。其次,通過(guò)研究雌二醇(E2)對(duì)

2、體外培養(yǎng)的水牛顆粒細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因和miRNA表達(dá)的影響,探索E2在調(diào)控水牛顆粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用,為優(yōu)化顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)條件以及進(jìn)一步了解水牛卵泡閉鎖機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　一、不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和miRNA的表達(dá)。
　　1.采用HE染色、DNA ladder分析和Tunel法檢測(cè)了HF、EF和PF三種不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HF卵泡腔中無(wú)脫落的顆粒細(xì)胞,其中的

3、顆粒細(xì)胞基因組 DNA沒(méi)有出現(xiàn)明顯的DNA ladder,細(xì)胞凋亡率為9.32％。EF卵泡內(nèi)壁結(jié)構(gòu)較松散,卵泡腔中可見(jiàn)到有少量脫落的顆粒細(xì)胞,其顆粒細(xì)胞基因組DNA出現(xiàn)明顯的DNA ladder,細(xì)胞凋亡率為17.24%。PF顆粒細(xì)胞大部分脫落于卵泡腔中,卵泡內(nèi)壁退化嚴(yán)重,基因組DNA降解嚴(yán)重,出現(xiàn)明顯的DNA ladder,凋亡率達(dá)20.26%。
　　2.利用qRT-PCR方法分析了不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和mi

4、RNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,死亡受體通路相關(guān)的Fas等基因在HF、EF、PF三種顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),且隨著卵泡閉鎖程度加深,其表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。TNFα基因在HF顆粒細(xì)胞中不表達(dá)而在EF和PF中表達(dá),TRAIL基因在三種顆粒細(xì)胞中均不表達(dá)。所檢測(cè)的線(xiàn)粒體通路相關(guān)基因在三種顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),其中Bcl-2、Bcl-xl和MCL-1基因在HF顆粒細(xì)胞表達(dá)最高,隨著卵泡閉鎖程度加深,其表達(dá)量逐漸降低;Bax等基因在PF顆粒細(xì)胞表達(dá)

5、最高,且隨著卵泡閉鎖程度加深其表達(dá)量逐漸升高。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因在三種顆粒細(xì)胞均有表達(dá),且隨著卵泡閉鎖程度加深其表達(dá)量逐漸升高。所檢測(cè)的包括 miR21-5P在內(nèi)的16條 miRNA在HF、EF和PF顆粒細(xì)胞均有表達(dá),其中miR21-5P等10條miRNA的表達(dá)水平隨著卵泡閉鎖程度加深呈先升高后下降的趨勢(shì);miR99a-5P等6條miRNA的表達(dá)量隨著卵泡閉鎖程度加深而逐漸降低。
　　3.運(yùn)用免疫組化方法分析了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

6、 Fas和Caspase3在不同閉鎖程度水牛卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示,Fas和Caspase3蛋白在HF、EF、PF顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),且隨著卵泡閉鎖程度加深其表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)。
　　二、E2對(duì)體外培養(yǎng)水牛顆粒細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　1.采用Tunel法分析了E2對(duì)體外培養(yǎng)水牛顆粒細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),濃度為10-5 mol/L的E2能夠有效抑制顆粒細(xì)胞凋亡,且呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性;而雌激素受體抑制劑ICI1

7、82780能夠阻斷這一效應(yīng)。
　　2.采用流式細(xì)胞儀分析了E2對(duì)水牛顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示,單獨(dú)添加10-5 mol/L E2處理顆粒細(xì)胞后,G0/G1期細(xì)胞比例減少,S期細(xì)胞比例顯著增加,ICI182780單獨(dú)處理和E2+ICI182780聯(lián)合處理的樣品細(xì)胞周期均沒(méi)有顯著變化。
　　3.利用 qRT-PCR技術(shù)分析了 E2對(duì)水牛顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和miRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,ERβ和Fas等凋亡相關(guān)基因及m

8、iRNA在不同處理組中均有表達(dá),E2處理后,ERβ和Bcl-2基因表達(dá)水平提高,Fas等基因和miR21-5p等 miRNA表達(dá)降低,其他處理組相關(guān)基因和miRNA表達(dá)無(wú)顯著變化。
　　4.采用western-blot方法檢測(cè)了E2對(duì)水牛顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,E2處理后Fas、Bax、caspase9蛋白表達(dá)量降低,其蛋白質(zhì)水平分析結(jié)果與mRNA水平表達(dá)情況一致。其他處理組3個(gè)蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著變化。