βig-h3在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)βig-h3與胃癌病理及腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)因素的關(guān)系
　　 目的：
　　 探討胃癌患者腹膜間皮細(xì)胞中βig-h3表達(dá)與胃癌生物學(xué)行為及腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)因素的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 一、研究對(duì)象
　　 病例來源于2011年5月-9月間中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科胃癌手術(shù)病例75例，其中男性51例，女性24例；平均年齡61歲(32-81歲)。另收集14例同期胃良性病變標(biāo)本作

2、為對(duì)照。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)取材手術(shù)開腹后，留取腹腔沖洗液，取部分腹腔液行細(xì)胞學(xué)檢查(Peritoneal lavage Cytology，PLC)；其余沖洗液沉渣提取總RNA深低溫冰箱凍存，擇期行RT-PCR檢測(cè)腹腔液中CEA mRNA。腹膜組織取自前下方腹壁，并立刻固定于10％的甲醛溶液，石蠟包埋、切片(5μm)，擇期行免疫組織化學(xué)染色。
　　 (二)結(jié)果分析按同本胃癌病理規(guī)約標(biāo)準(zhǔn)判定病理因素。

3、根據(jù)胃癌腹腔沖洗液PLC檢查結(jié)果分組為：PLC(-)組、PLC(+)組。排除非特異性染色的前提下，以腹膜間皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色、淺褐色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)記。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)含EB染色劑的2%瓊脂糖凝膠電泳，以199bp出現(xiàn)陽(yáng)性條帶為CEA mRNA陽(yáng)性。
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SpSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。各組間指標(biāo)比較用x2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

4、　　 一、胃癌和良性疾病對(duì)照組腹膜組織βig-h3免疫組化染色結(jié)果
　　 75例胃癌患者中，29例腹膜組織βig-h3免疫組化染色結(jié)果呈陽(yáng)性，46例呈陰性。14例胃良性疾病患者中，1例呈陽(yáng)性。胃癌組陽(yáng)性比率明顯高于良性疾病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.030)。
　　 二、腹膜組織βig-h3免疫組化染色結(jié)果與胃癌病理生物學(xué)行為的關(guān)系
　　 腹膜組織免疫組化陽(yáng)性率在未分化、彌漫狀生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的胃癌中升

5、高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在浸透漿膜(T4)(p=0.016)、漿膜呈腱狀及多彩彌漫型組(p=0.037)中明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、腹膜組織βig-h3免疫組化染色結(jié)果與肉眼腹膜轉(zhuǎn)移、PLC檢查及CEA mRNA結(jié)果的關(guān)系
　　 75例胃癌病例中，13例伴有肉眼腹膜轉(zhuǎn)移，20例腹腔脫落癌細(xì)胞呈陽(yáng)性；32例CEA mRNA結(jié)果陽(yáng)性。βig-h3表達(dá)陽(yáng)性率在肉眼腹膜轉(zhuǎn)移陽(yáng)性(p=0.002)、腹腔脫落癌細(xì)

6、胞陽(yáng)性(p=0.005)及CEA mRNA陽(yáng)性組(p=0.027)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 (1)胃癌患者腹膜間皮細(xì)胞可表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白βig-h3。
　　 (2)胃癌患者腹膜間皮細(xì)胞中βig-h3的表達(dá)量，隨胃癌病期進(jìn)展而增加。
　　 (3)胃癌患者腹膜間皮細(xì)胞中βig-h3的表達(dá)量與多種胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)因素密切相關(guān)，可成為預(yù)測(cè)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的指標(biāo)之一。
　　 第二部分

7、胃癌細(xì)胞上清及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞βig-h3蛋白的表達(dá)
　　 目的：
　　 研究胃癌細(xì)胞SGC-7901上清及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)可否促進(jìn)人類腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)βig-h3蛋白。
　　 材料與方法：
　　 一、材料
　　 胎牛血清(FBS)、RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基、重組人TGF-β1：人類腹膜間皮細(xì)胞系HMrSV5；胃癌細(xì)胞系SGC-7901；Anti-βig

8、-h3抗體和βig-h3 ELISA試劑盒；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG；超速離心機(jī)4K15；二氧化碳培養(yǎng)箱。
　　 二、方法
　　 培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC-7901，第3天培養(yǎng)液上清與DMEM培養(yǎng)液1:4混合液及0，1.0，10.0，50.0ng/ml TGF-β1分別刺激人類腹膜間皮細(xì)胞HMrSV50、3、6、12、24小時(shí)，ELISA方法檢測(cè)上清液中βig-h3蛋白濃度，Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)βig-h3

9、蛋白濃度。
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X-±S)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。各組間指標(biāo)比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、TGF-β1對(duì)腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)βig-h3水平的影響。
　　 正常對(duì)照組細(xì)胞上清液中有基礎(chǔ)量的βig-h3蛋白分泌，TGF-β1可刺激腹膜間皮細(xì)胞分泌βig-h3，且呈時(shí)間及濃度依賴性

10、。TGF-β1增加腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)βig-h3蛋白量，并呈時(shí)間及濃度依賴性。
　　 二、胃癌細(xì)胞上清刺激對(duì)聞皮細(xì)胞培養(yǎng)液中βig-h3及間皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)βig-h3水平的影響。
　　 胃癌細(xì)胞上清刺激間皮細(xì)胞，培養(yǎng)液中βig-h3于24小時(shí)可獲得最大濃度。腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)βig-h3表達(dá)含量于12小時(shí)達(dá)到高峰。
　　 結(jié)論：
　　 (1)正常腹膜間皮細(xì)胞可表達(dá)、分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白βig-h3。
　　 (

11、2)胃癌細(xì)胞上清及TGF-β1可促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞可表達(dá)、分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白βig-h3
　　 (3)胃癌細(xì)胞上清及TGF-β1的促進(jìn)作用呈濃度及時(shí)間依賴性增加。
　　 第三部分細(xì)胞外基質(zhì)蛋白βig-h3誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901粘附、增殖及遷移
　　 目的：
　　 研究細(xì)胞外基質(zhì)蛋白βig-h3可否誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901粘附、遷移及增殖。
　　 材料與方法：
　　 一、材料

12、　　 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、重組人βig-h3蛋白及四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、纖維粘連蛋白(FN)、Transwell小室、胃癌細(xì)胞系SGC-7901、超速離心機(jī)4K15、二氧化碳培養(yǎng)箱。
　　 二、方法
　　 (一)MTT法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞與βig-h3的粘附及增殖程度
　　 胎牛血清(BSA)、纖維粘連蛋白(FN)及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白βig-h3包被96孔板后，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞

13、SGC-7901接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。應(yīng)用MTT法檢測(cè)其與βig-h3粘附能力及粘附后的增殖能力
　　 (二)Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)βig-h3誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞遷移的能力
　　 在Transwell小室濾膜下表面覆以人重組βig-h3、BSA及FN包被，上室加入SGC-7901細(xì)胞懸液。37℃培養(yǎng)24小時(shí)，清洗，0.1%結(jié)晶紫染色10 min。光鏡下觀察記錄膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)。
　　 三、統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。各組間指標(biāo)比較用方差分析或t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、βig-h3支持SGC-7901細(xì)胞的粘附及增殖
　　 SGC-7901細(xì)胞對(duì)βig-h3和FN的粘附能力明顯高于BSA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)；βig-h3和FN兩組間差異不明顯(P>0.05)。BSA、FN

15、和βig-h3促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞增殖的能力漸次增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。
　　 二、βig-h3誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的遷移
　　 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)：βig-h3和FN具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞遷移的能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。Big-h3和FN兩組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)βig-h3可誘導(dǎo)細(xì)胞粘附，其