重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位對(duì)鴨的安全性研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(E.coli heat-labile enterotoxin B subunit，LTB)能夠與黏膜上皮細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1受體結(jié)合，具有很強(qiáng)的免疫原性和免疫增強(qiáng)活性，是目前最受關(guān)注的黏膜免疫佐劑之一。在其從實(shí)驗(yàn)室走向產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的過(guò)程中，重組LTB蛋白獲得高效表達(dá)和通過(guò)生物安全性評(píng)價(jià)是其關(guān)鍵研發(fā)環(huán)節(jié)。
　　本研究利用自動(dòng)發(fā)酵罐培養(yǎng)重組畢赤酵母進(jìn)行LTB表達(dá)。培養(yǎng)條件為溫度30℃，pH6.0，溶氧35

2、％，氨水和2％蛋白胨為氮源，補(bǔ)入發(fā)酵液總體積1％的甲醇作為碳源。初始碳源消耗完后依據(jù)溶氧曲線的波動(dòng)逐步增加甲醇的流加速度，使甲醇濃度維持在1.5％左右，誘導(dǎo)表達(dá)96 h，獲得重組LTB的高效分泌表達(dá)。以硫酸銨沉淀和Ni2+螯合柱親和層析等蛋白純化方法，獲得純度高達(dá)98％的重組LTB蛋白。以變性和非變性十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗(yàn)證了重組LTB的五聚體結(jié)構(gòu);神經(jīng)節(jié)苷脂GM1酶聯(lián)免疫吸附(GM1-ELISA)法檢

3、測(cè)結(jié)果表明，重組LTB具有與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合的生物活性。
　　采用GM1-ELISA測(cè)定LTB注射后不同時(shí)間點(diǎn)鴨血清中的LTB含量來(lái)研究LTB在鴨血清中的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明試驗(yàn)鴨血清中的LTB含量變化及維持時(shí)間與LTB注射劑量呈正相關(guān)。ELISA法檢測(cè)鴨血清中免疫球蛋白、細(xì)胞因子和可溶性CD4和CD8的水平，以評(píng)價(jià)LTB對(duì)鴨的免疫功能的影響。結(jié)果表明，高劑量LTB顯著提高IgG的水平(P＜0.01)，對(duì)IgA和IgM也有一定的

4、提高作用;顯著提高IL-6和IL-10水平(P＜0.05)，對(duì)TNF-α影響不顯著(P＞0.05);試驗(yàn)鴨血清中的CD4含量增加顯著(P＜0.05)，CD8含量有所下降，但不顯著(P＞0.05)。
　　LTB的安全性研究包括對(duì)LTB蛋白編碼基因和抗性標(biāo)記基因的殘留檢測(cè)、過(guò)敏反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)以及對(duì)鴨的毒性作用研究。結(jié)果表明，純化的重組LTB蛋白中未檢測(cè)到LTB蛋白編碼基因及抗性標(biāo)記基因的殘留，未引起試驗(yàn)鴨的過(guò)敏反應(yīng)，但能誘導(dǎo)試驗(yàn)鴨

5、產(chǎn)生與注射劑量呈正相關(guān)的抗LTB抗體水平。在連續(xù)3次肌肉注射LTB后觀察臨床癥狀和剖檢病理變化，并采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和大腦制備組織切片。HE染色切片觀察顯示50 mg/kg注射組肝細(xì)胞輕度濁腫變性，肺臟輕微炎癥，100 mg/kg注射組肝細(xì)胞濁腫變性明顯、肺臟重度炎癥、腦組織出現(xiàn)局灶性壞死;免疫酶組織化學(xué)染色觀察顯示LTB在各組織器官中以大腦含量最高，脾臟和肝臟次之，心臟和肺臟檢出量低。本研究結(jié)果明確了重組LTB的生物安全