HPV16 E6-E7共同啟動子shRNA慢病毒的構(gòu)建及其對宮頸癌細(xì)胞株抑制作用的體內(nèi)外研究.pdf

1、宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一。盡管官頸癌篩查在不斷普及，但仍有大量浸潤性宮頸癌被診斷。手術(shù)和放療是宮頸癌的根治性治療手段，但手術(shù)僅適用于早期病例。放療雖然適合于各期病例，但可對卵巢和陰道造成不可逆的損傷，嚴(yán)重影響年輕患者的生活質(zhì)量。宮頸癌對化療僅中等敏感，故目前化療主要應(yīng)用于宮頸癌局部晚期病例的輔助性治療和晚期病例的姑息性治療。鑒于上述各種原因，浸潤性宮頸癌的預(yù)后并不樂觀。因此，尋找常規(guī)手術(shù)、放療和化療以外的新的治療方法，對改善宮頸癌

2、預(yù)后有重要的現(xiàn)實意義。
　　業(yè)已公認(rèn)，高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病關(guān)鍵的和必要的致病因素。在所有HPV感染中，16型占了50％以上。FIR-HPV E6/E7癌基因的過度表達(dá)不僅是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的關(guān)鍵基因，也是維持宮頸癌惡性表型的關(guān)鍵基因。宮頸癌明確的致病因素和致病機(jī)理為HR-HPV感染和宮頸癌的阻斷治療提供了明確的靶標(biāo)。
　　RNAi能高效、特異地抑制某個基因的表達(dá)，故在病毒相關(guān)性疾病、遺傳性疾病

3、及惡性腫瘤的功能基因組的研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。由于宮頸癌細(xì)胞中整合的HPV癌基因?qū)儆谕庠葱?，與人體自身基因無同源性，及明確的靶標(biāo)為基因阻斷(RNAi)治療提供了一個理想模型。
　　siRNA介導(dǎo)的基因沉跌可分為轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平。鑒于HPV16早期癌蛋白E6和E7受共同啟動子p97調(diào)控，因此我們采用了有別于傳統(tǒng)siRNA與編碼區(qū)序列同源的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默方法。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的作用機(jī)制是：與啟動子區(qū)CpG島同源的siRN

4、A可通過誘導(dǎo)RNA引導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)、組蛋白的修飾和異染色質(zhì)的形成等表觀遺傳改變導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。此方法的優(yōu)勢是：沉默過程不涉及DNA序列改變的表觀遺傳學(xué)改變，并可通過印記遺傳給子代，使基因沉默具有遺傳效應(yīng)。
　　合適的載體是siRNA介導(dǎo)基因沉默的重要環(huán)節(jié)。其中慢病毒載體以其在臨床前治療及臨床試驗中已表現(xiàn)明顯的優(yōu)勢。慢病毒與其他病毒載體相比，具有操作簡潔，感染效能高，可感染細(xì)胞廣，轉(zhuǎn)移基因片段容量大，作用穩(wěn)定

5、(這更適合在腫瘤中應(yīng)用)，安全性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前基因治療和轉(zhuǎn)基因動物中載體研究的良好運(yùn)載工具。
　　在本研究中，我們首先構(gòu)建慢病毒載體搭載HPV16 E6/E7啟動子shRNA和E6編碼區(qū)shRNA，其次轉(zhuǎn)導(dǎo)宮頸癌HPV16陽性細(xì)胞株Siha和Caski，篩選并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株，檢測單克隆細(xì)胞株中HPV16 E6/E7在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化，同時檢測了E6相關(guān)蛋白MCM7和p53，E7相關(guān)蛋白pRB和p16的表達(dá)變

6、化。隨后觀察LV-shRNA導(dǎo)入前后細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的變化。最后，分別將Siha和Caski穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株及其陰性對照組細(xì)胞接種于裸鼠皮下，詳細(xì)記錄體內(nèi)成瘤及生長情況及裸鼠體重變化。至觀察階段性中點(diǎn)，部分裸鼠安樂死后剝離瘤體稱重，剩余裸鼠繼續(xù)觀察生存期。旨在證明轉(zhuǎn)錄水平siRNA基因沉默的有效性及探討癌基因E6/E7在體內(nèi)外導(dǎo)致官頸惡性轉(zhuǎn)化和維持惡性表型中的作用，為探索宮頸癌治療新策略和新靶點(diǎn)提供實驗依據(jù)。
　　第一部分靶

7、向HPV16 E6/E7共同啟動子shRNA慢病毒的構(gòu)建及鑒定
　　目的：
　　以HPV16 E6/E7共同啟動子為靶標(biāo)設(shè)計shRNA序列，構(gòu)建慢病毒載體，為后續(xù)證明轉(zhuǎn)錄水平siRNA穩(wěn)定基因沉默有效性的研究提供工具。
　　方法：
　　根據(jù)BLOCK-iTTM Lentiviral RNAi Expression System要求設(shè)計特異性靶向HPV16 E6/E7共同啟動子的shRNA序列，經(jīng)由上海生工合成后，

8、將shRNA序列導(dǎo)入pENTRTM/U6入門載體，小抽質(zhì)粒測序。再將測序正確的pENTRTM/U6入門載體導(dǎo)入pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST生成表達(dá)載體，中抽質(zhì)粒，雙酶切，電泳鑒定。隨后將鑒定正確的表達(dá)載體與ViraPowerTM包裝混合物共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝出病毒。最后進(jìn)行病毒濃縮及經(jīng)典的HT1080細(xì)胞進(jìn)行滴度測定。
　　結(jié)果：
　　1.pENTRTM/U6入門載體小提質(zhì)粒后測序提示插入序列正確。<

9、br>　　2.入門載體導(dǎo)入pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST表達(dá)載體，雙酶切，電泳鑒定正確。
　　3.包裝所得病毒液滴度測定結(jié)果為2.2*106TU/ml。
　　4.Siha、Caski和HT1080三種細(xì)胞的Blasticidin最小致死濃度結(jié)果分別為4ug/ml，6ug/ml和4ug/ml。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了搭載HPV16 E6/E7共同啟動子shRNA重組慢病毒載體。
　　2

10、.成功包裝了高滴度的重組慢病毒。
　　第二部分慢病毒介導(dǎo)的E6/E7共同啟動子shRNA對官頸癌細(xì)胞株生長抑制作用的體外研究
　　目的：
　　證明我們構(gòu)建的搭載HPV16 E6/E7共同啟動子shRNA重組慢病毒載體在轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定沉默E6/E7癌基因的有效性，并探討癌基因E6/E7在體外維持惡性表型中的作用。
　　方法：
　　首先將慢病毒對Siha/Caski細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，采用Western-blot法檢測

11、細(xì)胞內(nèi)核纖維蛋白laminA/C的變化，得出每個細(xì)胞株最佳MOI值。根據(jù)最佳MOI值轉(zhuǎn)導(dǎo)Siha/Caski細(xì)胞，并用相應(yīng)的Blasticidin濃度篩選，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。采用無限稀釋法，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞，并使用Realtime-PCR法檢測E6，E7 mRNA的表達(dá)水平，篩選最佳穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株。隨后用Western-blot法，MTT法及Transwell小室檢測兩穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株的E6、MCM7、p53、E7、pRB、p16蛋白

12、的改變，增殖及侵襲能力的變化，以驗證轉(zhuǎn)錄水平的干擾效果。
　　結(jié)果：
　　1.Siha細(xì)胞最佳MOI值為2；Caski最佳MOI值為5。
　　2.成功篩選出Siha/Caski穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株。
　　3.慢病毒介導(dǎo)的E6/E7共同啟動子shRNA有效抑制了Siha/Caski穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株E6/E7 mRNA的表達(dá)。
　　4.慢病毒介導(dǎo)的E6/E7共同啟動子shRNA有效抑制了E6、MCM7、E7、p16

13、蛋白的表達(dá)，上調(diào)了p53和pRB蛋白的表達(dá)。
　　5.慢病毒介導(dǎo)的E6/E7共同啟動子shRNA有效抑制了穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株的增殖能力和侵襲能力。
　　結(jié)論：
　　1.慢病毒是攜帶干擾RNA進(jìn)入宮頸癌細(xì)胞的理想載體。
　　2.LV-shRNA能有效將治療基因?qū)雽m頸癌細(xì)胞，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)單克隆細(xì)胞株。
　　3.慢病毒介導(dǎo)的E6/E7共同啟動子shRNA能特異性抑制官頸癌單克隆細(xì)胞E6/E7mRNA和蛋白水平的表達(dá)，

14、并有效抑制宮頸癌單克隆細(xì)胞株的增殖與侵襲力。
　　第三部分慢病毒介導(dǎo)的E6/E7共同啟動子shRNA對官頸癌移植瘤生長抑制作用的體內(nèi)研究
　　目的：
　　證明我們構(gòu)建的搭載HPV16 E6/E7共同啟動子shRNA重組慢病毒載體能有效抑制動物體內(nèi)宮頸癌移植瘤的生長，為官頸癌治療提供新的治療手段。
　　方法：
　　將慢病毒介導(dǎo)的E6/E7共同啟動子shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)宮頸癌Siha/Caski單克隆細(xì)胞株接種于裸鼠

15、皮下，觀察其在裸鼠荷瘤模型中成瘤能力，觀察并詳細(xì)記錄裸鼠生長情況、每只裸鼠體重以及裸鼠生存期數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立荷瘤裸鼠模型，成瘤率100％。
　　2.荷瘤裸鼠各實驗組與相應(yīng)對照組之間裸鼠體重變化較為一致，無明顯差異。
　　3.荷瘤裸鼠LV-shRNA實驗組瘤體生長速度明顯緩于對應(yīng)的對照組，并且裸鼠解剖后離體瘤的重量也明顯小于相應(yīng)的對照組。
　　4.荷瘤裸鼠LV-shRNA實驗組生存時間明顯