沉默HPV16 E6-E7基因?qū)m頸鱗癌EMT和Wnt通路的作用.pdf

1、目的:高危型人乳頭瘤病毒(human papillomaviarus，HPV)是90％宮頸癌的病因，其中HPV16和18型約占70％。高危型HPV持續(xù)性感染宿主細(xì)胞，并將其致癌基因E6/E7整合到宿主細(xì)胞中使其永生化并具備了侵襲和轉(zhuǎn)移能力是宮頸癌的主要發(fā)病機(jī)制。
　　上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間的粘附，獲

2、得了間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和特性，典型的特征就是上皮的E-cadherin轉(zhuǎn)換為間質(zhì)的N-cadherin。EMT的發(fā)生機(jī)制與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此它也是多種腫瘤研究的焦點(diǎn)，但是在宮頸癌中的研究仍然較少，宮頸上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生是否與高危型HPV相關(guān)迫切需要我們更深入地研究。
　　多種信號(hào)途徑與EMT的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，Wnt通路就其中一條很重要的信號(hào)途徑。Wnt通路異常激活誘導(dǎo)腫瘤EMT的發(fā)生在多種腫瘤的研究中得到證實(shí)，但在宮頸癌的E

3、MT中發(fā)揮何種作用尚不清楚。
　　綜上所述，我們推斷高危型HPV可能經(jīng)Wn信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸癌EMT的發(fā)生。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來(lái)新興起的一門在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默目的基因的技術(shù)。siRNA、shRNA和miRNA都是RNAi的有利工具，盡管體內(nèi)體外的各種轉(zhuǎn)染技術(shù)多種多樣，但是RNAi技術(shù)顯示出了明顯的高效、特異性，也因此成為了一種有利的研究手段。
　　本課題組的前期試驗(yàn)證明，

4、沉默HPV16 E6/E7基因可以在體外抑制宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，但缺乏體內(nèi)試驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)分別抑制人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞裸鼠移植瘤中HPV16 E6/E7基因的表達(dá)，觀察對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用，并觀察對(duì)EMT指標(biāo)E-cadherin、N-cadherin以及Wnt和β-catenin的作用，由此證實(shí)HPV16 E6/E7對(duì)宮頸鱗癌EMT和Wnt通路的作用。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)HPV16陽(yáng)性的人宮頸

5、癌細(xì)胞SiHa。
　　2.擴(kuò)增并提取miRNA干擾質(zhì)粒，包括HPV16 E6-miRNA、HPV16E7-miRNA干擾質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照Neg-miRNA空白質(zhì)粒。
　　3.將SiHa細(xì)胞接種到BALB/c裸鼠右前腋窩中部外側(cè)皮下，觀察成瘤情況并分隨機(jī)分成4組，包括2個(gè)對(duì)照組和2個(gè)治療組。對(duì)照組為生理鹽水組（簡(jiǎn)稱鹽水對(duì)照組）和空質(zhì)粒組(Neg-miRNA組)，治療組為HPV16E6基因沉默組(HPV16 E6-miRNA組

6、)和HPV16 E7基因沉默組(HPV16E7-miRNA組)。
　　4.用體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑溶解miRNA質(zhì)粒，定期定量對(duì)4組裸鼠分別行瘤內(nèi)多點(diǎn)注射生理鹽水、Neg-miRNA、HPV16 E6-miRNA、HPV16E7-miRNA。每次注射前測(cè)量腫瘤體積，觀察沉默E6/E7基因?qū)δ[瘤生長(zhǎng)的影響。
　　5.移植瘤取材，測(cè)移植瘤長(zhǎng)短徑和瘤重，分裝標(biāo)本，分別用Real-TimePCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)目的基因的mRNA及其蛋白的表

7、達(dá)情況，包括HPV16 E6、HPV16 E7、E-cadherin、N-cadherin、Wnt1和β-catenin。分析E6/E7基因沉默對(duì)移植瘤生長(zhǎng)、EMT指標(biāo)和Wnt通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1.裸鼠皮下移植瘤的建立
　　1.1 荷瘤小鼠全部存活，大約皮下接種20天后，肉眼可見明顯的移植瘤，體積約為約80-120mm3，成瘤率100％。肉眼觀察裸鼠移植瘤外形不規(guī)則，個(gè)別瘤體可出現(xiàn)潰破和出血。實(shí)驗(yàn)中4組小鼠

8、均無(wú)明顯精神萎靡，行動(dòng)遲緩及消瘦等變化，接種SiHa細(xì)胞前和處死前的小鼠體重?zé)o明顯變化。
　　1.2 剝除后大體觀察瘤塊:腫瘤為非浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，有胞膜，與周圍組織界限清楚，易分離，質(zhì)硬，瘤體切面可見灰白色壞死灶，未見明顯血管。
　　2.通過(guò)體內(nèi)分別沉默HPV16 E6和E7基因，兩個(gè)miRNA處理組裸鼠移植瘤在小鼠被處死前的體積均小于兩個(gè)對(duì)照組，P＜0.05，同樣腫瘤重量也明顯減輕，P＜0.05。
　　3.各組中HPV1

9、6 E6和E7 mRNA的表達(dá)采用Real-Time PCR的方法，分別檢測(cè)HPV16 E6-miRNA、HPV16E7-miRNA轉(zhuǎn)染的各組以及空質(zhì)粒組和鹽水對(duì)照組的HPV16 E6和E7mRNA的表達(dá)。HPV16 E6基因沉默組與鹽水對(duì)照組比較，HPV16 E6mRNA的表達(dá)水平降低，差異顯著，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;空質(zhì)粒組和HPV16 E7基因沉默組分別與鹽水對(duì)照組比較，HPV16 E6 mRNA的表達(dá)無(wú)差異，P＞0.05

10、，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPV16 E7基因沉默組與鹽水對(duì)照組比較，HPV16 E7 mRNA的表達(dá)水平降低，差異顯著，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;空質(zhì)粒組和HPV16 E6基因沉默組分別與鹽水對(duì)照組比較，HPV16 E7 mRNA的表達(dá)無(wú)差異，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這組數(shù)據(jù)說(shuō)明HPV16 E6-miRNA和HPV16 E7-miRNA瘤內(nèi)注射成功促使SiHa細(xì)胞宮頸癌裸鼠移植瘤中的HPV16 E6/E7基因沉默。
　　4.EMT

11、的標(biāo)志物E-cadherin和N-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)水平采用Real-Time PCR和免疫組化方法，分別檢測(cè)4組移植瘤中E-cadherin和N-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)水平。HPV16 E6基因沉默組和HPV16 E7基因沉默組分別與鹽水對(duì)照組比較，E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高，N-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)均降低，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？召|(zhì)粒組與鹽水

12、對(duì)照組比較，E-cadherin和N-cadherinmRNA和蛋白的表達(dá)水平無(wú)差異，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明SiHa細(xì)胞宮頸癌移植瘤中的HPV16 E6/E7基因沉默后發(fā)生了“鈣粘蛋白的轉(zhuǎn)換”，N-cadherin轉(zhuǎn)換為E-cadherin。
　　5.Wnt信號(hào)通路中Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)水平采用Real-Time PCR和免疫組化方法，分別檢測(cè)4組移植瘤中的Wnt1和β-catenin

13、 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。HPV16 E6基因沉默組和HPV16 E7基因沉默組分別與鹽水對(duì)照組比較，Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)水平均降低，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？召|(zhì)粒組與鹽水對(duì)照組比較，Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)水平無(wú)差異，P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明SiHa細(xì)胞宮頸癌移植瘤中的HPV16 E6/E7基因沉默后，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受抑制。
　　

14、結(jié)論:
　　1.成功建立了SiHa細(xì)胞宮頸鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型，可用于宮頸癌的體內(nèi)研究。
　　2.體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)我們前期利用體外實(shí)驗(yàn)篩選出的HPV16E6-miRNA和HPV16 E7-miRNA可以特異、高效的沉默HPV16 E6和E7基因。
　　3.沉默HPV16 E6/E7基因可以抑制SiHa細(xì)胞宮頸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。
　　4.沉默HPV16 E6/E7基因可促使宮頸癌EMT發(fā)生逆轉(zhuǎn)，且這個(gè)過(guò)程可能