化學(xué)合成siRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa中E6基因表達(dá)的抑制作用.pdf

1、目的：探討體外化學(xué)合成的HPV(human papolloma virus)16E6的siRNA對(duì)HPV16陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞中HPV16 E6基因的抑制作用和對(duì)SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為變化的誘導(dǎo)作用。 方法：化學(xué)合成三條針對(duì)HPV16 E6的siRNA序列，用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分兩組：未轉(zhuǎn)染組和siRNA轉(zhuǎn)染組。用半定量RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增)技術(shù)分別檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組及siRNA轉(zhuǎn)染后24h

2、，48h，72h時(shí)HPV16E6基因mRNA的表達(dá)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞活性，流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期變化，細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)水平的變化，透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：1.3條siRNA均能有效抑制E6mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以siRNA1作用效果最為明顯。 2.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示20nmol/L、50nmol/L和80nmol/L終濃度轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活

3、性均有所下降，其中以50nmol/L轉(zhuǎn)染時(shí)增殖活性下降最明顯。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后G0/G1期細(xì)胞數(shù)占生長(zhǎng)周期細(xì)胞數(shù)的比例增多，即表現(xiàn)為G1期阻滯，S期細(xì)胞的比例降低。 4.細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染72h后p53蛋白表達(dá)水平增高，轉(zhuǎn)染前后差異有顯著性(P<0.05)。 5.轉(zhuǎn)染72 h后透射電鏡下可見細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)濃縮，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡。 結(jié)論：化學(xué)合成siRNA可有效沉默SiHa細(xì)胞E6基因