RAGE在MGO誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α和IFN-γ中的作用.pdf

1、目的：甲基乙二醛（MGO）是葡萄糖活性代謝產(chǎn)物，晚期糖化終產(chǎn)物受體（RAGE）可抑制MGO代謝的關(guān)鍵酶乙二醛酶1（GLO-1）。MGO和晚期糖化終產(chǎn)物受體的水平在糖尿病人中明顯增高，與糖尿病加速動脈粥樣硬化有關(guān)，但它們之間相互作用在糖尿病加速動脈粥樣硬化中的意義仍不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MGO誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IFN-γ。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究RAGE及其胞內(nèi)信號對MGO誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α和I

2、FN-γ的影響，為了解糖尿病加速動脈粥樣硬化機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：①不同濃度的MGO（0、15、30、60μM）作用PHA（0.25μg/ml）預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞24h，Western blot檢測RAGE表達(dá)。②不同濃度MGO（0、15、30、60μM）作用于PHA預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞24h，ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的分泌；部分實(shí)驗(yàn)加RAGE抗體（1μg/ml）預(yù)處理，同時設(shè)非特異抗體（1μg/m

3、l）為對照。③不同濃度MGO（0、15、30、60μM）作用PHA預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞24h,Western blot測鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV（CaMKIV）的表達(dá)；部分實(shí)驗(yàn)加RAGE抗體（1μg/ml）預(yù)處理，同時設(shè)非特異抗體（1μg/ml）為對照。免疫熒光檢測30μM MGO作用0、15、30、60min后的Jurkat細(xì)胞內(nèi)CaMKIV轉(zhuǎn)核情況；部分實(shí)驗(yàn)加RAGE抗體（1μg/ml）預(yù)處理，同時設(shè)非特異抗體（1μg/ml）

4、為對照。④30μM MGO作用PHA預(yù)刺激24h的Jurkat細(xì)胞0、15、30、60min，Western blot檢測p38MAPK磷酸化表達(dá)；部分實(shí)驗(yàn)加RAGE抗體（1μg/ml）預(yù)處理，同時設(shè)非特異抗體（1μg/ml）為對照。⑤30μM MGO作用于CaMKIV抑制劑KN62（10μM）、p38 MAPK抑制劑SB203580（25μM）預(yù)處理的Jurkat24h，ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的分泌。
　　結(jié)果：①

5、MGO作用于PHA預(yù)刺激的Jurkat細(xì)胞24小時，Western Blot顯示Jurkat細(xì)胞表達(dá)RAGE，15、30、60μM MGO均上調(diào)RAGE的表達(dá)，與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②15、30、60μM MGO作用于Jurkat細(xì)胞24h可促使Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α及IFN-γ，與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。RAGE抗體能抑制MGO誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α及IF

6、N-γ（p<0.05），而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞分泌TNF-α及IFN-γ無影響（p>0.05）。③15-60μM MGO能增加CaMKIV的表達(dá)，與MGO未作用組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。RAGE抗體抑制MGO誘導(dǎo)的CaMKIV的表達(dá)（p<0.05）；而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)CaMKIV的表達(dá)無影響（p>0.05）。免疫熒光顯示30μM MGO作用15-60min促進(jìn)Jurkat細(xì)胞CaMKIV

7、核轉(zhuǎn)位；RAGE抗體抑制MGO誘導(dǎo)的CaMKIV蛋白核轉(zhuǎn)位，而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)CaMKIV蛋白核轉(zhuǎn)位無影響。④30μM MGO作用Jurkat細(xì)胞15-60min引起Jurkat細(xì)胞內(nèi)p38MAPK磷酸化表達(dá)增加（p<0.05）；RAGE抗體抑制MGO引起的p38MAPK磷酸化（p<0.05），而非特異抗體預(yù)處理對MGO誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化無影響（p>0.05）。⑤CaMKIV，p38MAPK通路抑制劑預(yù)處理抑制MGO誘