三氧化二砷聯(lián)合全反式維甲酸抗人卵巢癌細(xì)胞機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤之一，在治療難題中的主要原因是化療藥物的耐藥及化療藥物所帶來的全身毒副作用，限制了患者的依從性，降低了患者的生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致化療的失敗。因此，尋找新的、具有協(xié)同作用的化療藥物越來越引起人們的關(guān)注。三氧化二砷(arsenictrioxide，AS2O3)是中藥復(fù)方青黛、砒霜等的主要有效成分。AS2O3通過降解早幼粒細(xì)胞白血病基因PML和維甲酸受體α基因RARα融合所表達(dá)的PML-RARα融合蛋白，調(diào)節(jié)谷胱

2、甘肽還原系統(tǒng)、發(fā)揮細(xì)胞周期抑制和促凋亡等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。目前，AS2O3已經(jīng)應(yīng)用于白血病的臨床治療，主要用于治療復(fù)發(fā)及難治性急性早幼粒細(xì)胞白血病APL[1]。
　　 維甲酸類化合物(retinoids，即維生素A衍生物之稱)通過激活相應(yīng)的受體，識(shí)別靶基因的應(yīng)答部位，以蛋白質(zhì)-核酸的結(jié)合形式調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)。天然的全反式維甲酸(all-transretinoic acid，A

3、TRA)是生物學(xué)活性最強(qiáng)的維生素A的衍生物，已廣泛應(yīng)用于臨床皮膚癌的治療。ATRA的抗腫瘤作用的證實(shí)被譽(yù)為九十年代國(guó)際抗癌藥物的三大發(fā)現(xiàn)之一，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)分化腫瘤細(xì)胞作用，已成為治療APL的一線藥物。
　　 近年來，細(xì)胞周期及其相關(guān)的周期調(diào)節(jié)蛋白已成為腫瘤發(fā)病機(jī)制及化療藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，在細(xì)胞周期的進(jìn)程中存在多個(gè)調(diào)控點(diǎn)，其中G1/S和G2/M調(diào)控點(diǎn)最為重要，細(xì)胞增殖除受到細(xì)胞周期的幾個(gè)調(diào)控點(diǎn)作用外，還受到細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑

4、制劑(cycle dependent kinases inhibitors，CKIs)的調(diào)控，常見的如P27和P16。P27蛋白通過抑制細(xì)胞周期蛋白的活性和細(xì)胞周期蛋白激酶(cycle dependent kinases，CDKs)的激活，發(fā)揮抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的作用。因此，細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)和CKIs的缺失將使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。關(guān)于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子異常與腫瘤發(fā)病機(jī)制之間的研究多集中于G1/S期，對(duì)G2/M期調(diào)節(jié)的研

5、究較少，因此，對(duì)細(xì)胞周期G2/M期調(diào)控機(jī)制的研究，有助于我們更好地了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制及合理的應(yīng)用化療藥物。
　　 關(guān)于卵巢癌的臨床治療，目前仍多采用以順鉑為基礎(chǔ)的兩種或多種化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，藥物之間的關(guān)系多為單純性的相加作用，即化療作用相加的同時(shí)全身的毒副作用也是相加的，能否通過尋找具有協(xié)同作用的兩種藥物，發(fā)揮治療作用的同時(shí)，毒副作用不會(huì)增加，甚至降低，從而提高卵巢癌患者的生活質(zhì)量，一直是我們關(guān)心的熱點(diǎn)。
　　 目的<

6、br>　　 本實(shí)驗(yàn)采用ATRA不敏感型、人漿液性上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，擬通過AS2O3及ATRA單獨(dú)或聯(lián)合用藥，觀察不同藥物組對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制、殺傷與促凋亡效應(yīng)的影響，探討兩種藥物間的相互作用及與細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控蛋白P27之間可能的關(guān)系，為卵巢癌的化療提供新的思路及理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 以ATRA不敏感型、人漿液性上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為：正常對(duì)照組(含

7、10％小牛血清的1640培養(yǎng)液)、ATRA組(1.0μmol/LATRA)、AS2O3組(5.0μmol/LAS2O3)和聯(lián)合組(1.0μmol/LATRA和5.0μmol/LAS2O3)，分別按分組培養(yǎng)的所需時(shí)間取樣。四甲基偶氮唑藍(lán)光吸收法MTT，檢測(cè)不同組處理24～96h對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)，觀察不同藥物組作用48h對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期阻滯、凋亡及壞死情況的影響；通過免疫熒光法檢測(cè)不同藥物組、

8、不同時(shí)間點(diǎn)，人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控蛋白P27的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1 AS2O3、ATRA單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響
　　 四甲基偶氮唑藍(lán)光吸收法結(jié)果顯示：ATRA組中SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制狀況，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。AS2O3組和聯(lián)合組中，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，與對(duì)照組

9、相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。聯(lián)合組與AS2O3組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2 AS2O3、ATRA單獨(dú)或聯(lián)合用藥48h對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期、凋亡率及壞死率的影響
　　 流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)：SKOV3經(jīng)不同藥物組處理后，細(xì)胞周期阻滯不同，以48h最顯著。AS2O3組和聯(lián)合組均出現(xiàn)G0/G1期和G2/M雙重阻滯，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。聯(lián)合組與

10、AS2O3組相比，G2/M期阻滯更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。AnnexinV/PI染色檢測(cè)凋亡，AS2O3組和聯(lián)合組中，細(xì)胞凋亡率和壞死率均增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。聯(lián)合組與AS2O3組相比，凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，壞死率無增加，反而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3 AS2O3、ATRA單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中P27蛋白表達(dá)的

11、影響
　　 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)法顯示：不同藥物組SKOV3細(xì)胞中P27蛋白的表達(dá)不同，AS2O3組和聯(lián)合組中P27蛋白的表達(dá)有時(shí)間依賴性，48h表達(dá)最強(qiáng)，96h仍然維持在較高水平，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；聯(lián)合組中P27蛋白表達(dá)量更為明顯，與AS2O3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)AS2O3上調(diào)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中P27蛋白的表達(dá)，提高SKOV